PKD1- und PKD2-mRNA cis

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4765 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), eine der häufigsten genetischen Erkrankungen des Menschen und eine häufige Ursache für Nierenversagen, wird hauptsächlich durch heterozygote PKD1-Mutationen verursacht. Die Bildung von Nierenzysten tritt auf, wenn die PKD1-Dosierung unter einen kritischen Schwellenwert fällt. Es gibt jedoch keinen Rahmen, um das verbleibende Allel zu nutzen oder den PKD1-Rückgang umzukehren. Hier zeigen wir, dass mRNAs, die vom nichtinaktivierten PKD1-Allel produziert werden, über ihr 3′-UTR-miR-17-Bindungselement unterdrückt werden. Die Eliminierung dieses Motivs (Pkd1∆17) verbessert die mRNA-Stabilität, erhöht die Polycystin-1-Spiegel und lindert das Zystenwachstum in zellulären, Ex-vivo- und Maus-PKD-Modellen. Bemerkenswerterweise wird Pkd2 auch über sein 3′-UTR-miR-17-Motiv gehemmt, und die durch Pkd2∆17 induzierte Polycystin-2-Derepression verzögert das Zystenwachstum in Pkd1-Mutantenmodellen. Darüber hinaus schwächt eine akute Blockierung der Pkd1/2-cis-Hemmung, auch nach Beginn der Zyste, die murine PKD ab. Schließlich führt die Modellierung von PKD1∆17- oder PKD2∆17-Allelen in vom Patienten stammenden primären ADPKD-Kulturen zu kleineren Zysten, reduzierter Proliferation, geringerer pCreb1-Expression und einem verbesserten Mitochondrienmembranpotential. Daher ist die Umgehung der 3′-UTR-cis-Interferenz und die Verbesserung der PKD1/2-mRNA-Translation ein potenziell mutationsunabhängiger ADPKD-hemmender Ansatz.

Schätzungsweise 12,5 Millionen Menschen weltweit leiden an der autosomal-dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD), was sie zu den häufigsten monogenetischen Erkrankungen der Menschheit macht. Ein klinisches Kennzeichen von ADPKD ist das unaufhörliche Wachstum unzähliger mit Flüssigkeit gefüllter Zysten in den Nieren, die das normale Parenchym ersetzen und über Jahrzehnte zu einer massiven beidseitigen Nierenvergrößerung und Nierenversagen führen1. ADPKD tritt aufgrund heterozygoter Mutationen mit Funktionsverlust in PKD1 (~78 % der Fälle) oder PKD2 (~15 % der Fälle) auf. Die klassische Hypothese für die Entstehung von Zysten ist, dass zusätzlich zu einer die Keimbahn inaktivierenden Mutation in einem Allel des PKD-Gens eine somatische Inaktivierung (als zweiter Treffer bezeichnet) im anderen Allel auftritt, was zu einem vollständigen Verlust der Polycystin-Expression in der Zelle führt . In den letzten Jahren gibt es jedoch mehrere Belege dafür, dass die Gendosisschwelle ein an der Zystogenese beteiligter Mechanismus ist2,3. Diese Hypothese besagt, dass kein vollständiger PKD1-Verlust erforderlich ist, sondern dass es zu einer Zystogenese kommt, wenn die funktionelle PKD1-Dosierung unter einen kritischen Schwellenwert fällt. Unterstützt das Gendosierungsmodell ist die Inaktivierung der Second-Hit-Mutation kein universelles Merkmal, insbesondere bei kleineren ADPKD-Zysten4,5,6,7. Wichtig ist, dass viele Personen mit ADPKD weiterhin eine restliche PC1-Expression aufweisen, da sie Missense-Keimbahn-PKD1-Mutationen (anstatt sie zu inaktivieren) tragen8,9,10. Als Beweis des Prinzips reicht eine Verringerung der Pkd1-Dosis aus, um PKD bei Mäusen, Schweinen und Affen zu erzeugen4,11,12,13,14,15,16. Wenn also eine reduzierte Dosierung ADPKD verursacht, könnte eine Erhöhung der Expression des normalen PKD1-Allels die Störung stoppen. Trotz dieses transformativen Potenzials sind die Faktoren, die die PKD1-Dosierung bei ADPKD steuern, jedoch größtenteils unbekannt, und derzeit gibt es keine Mechanismen zur Aktivierung des normalen PKD1-Allels.

Die 3′-untranslatierte Region (3′-UTR), der mRNA-Teil, der unmittelbar stromabwärts des Translationsterminationscodons liegt, schützt die mRNA vor Abbau und erleichtert die Translation durch ihren Poly(A)-Schwanz17. Paradoxerweise kann die 3′-UTR über die Interaktion mit microRNAs (miRNAs) auch die Unterdrückung oder Deadenylierung der mRNA-Translation vermitteln18,19,20,21. Die meisten mRNA-3′-UTRs enthalten evolutionär konservierte miRNA-bindende Elemente (MBEs), was darauf hindeutet, dass die cis-Hemmung der Translation ein allgegenwärtiger Modus der Gen-Output-Regulierung ist22. Dieser faszinierende Aspekt der 3′-UTR-Funktion ist jedoch nur unzureichend beschrieben. Die Prognose besagt, dass einzelne MBEs einen geringen Einfluss auf die mRNA-Funktion des Wirts haben, wenn man bedenkt, dass miRNAs hauptsächlich als Rheostatika wirken und mRNA-Ziele geringfügig unterdrücken. Entgegen dieser vorherrschenden Logik kamen wir zu dem Schluss, dass unter bestimmten Umständen, beispielsweise wenn die Gendosis aufgrund einer Haploinsuffizienz bereits reduziert ist, die MBE-vermittelte cis-Hemmung des verbleibenden Allels eine krankheitsmodifizierende Wirkung haben könnte, indem sie die endgültige Proteinproduktion steuert.

Unser Ziel war es herauszufinden, ob eine monoallele PKD1-Derepression möglich ist und wie sie das präklinische Fortschreiten der ADPKD beeinflusst. PKD1 enthält ein miR-17-Bindungsmotiv in seiner 3′-UTR, und miR-17-Expression und -Aktivität sind in ADPKD-Modellen höher4,23,24,25,26. Daher haben wir die Idee getestet, dass PKD1-mRNA durch ihr 3′-UTR-miR-17-Motiv cis-inhibiert wird und dass die Blockierung dieser Inhibition den PKD1-Rückgang umkehrt. Wir verwenden CRISPR/Cas9-Editierung, um das miR-17-Motiv aus dem PKD1-Gen in monoallelen ADPKD-Modellen zu löschen. Wir stellen fest, dass die Eliminierung des miR-17-Motivs ausreicht, um die Pkd1-mRNA-Stabilität zu verbessern, die Polycystin-1 (PC1)-Expression zu erhöhen und das Zystenwachstum in zellulären, Ex-vivo- und Maus-PKD-Modellen zu verbessern. Das andere ADPKD-Gen, PKD2, enthält ebenfalls ein 3′-UTR-miR-17-Bindungsmotiv; Bemerkenswerterweise erhöht die Löschung dieses miR-17-Motivs den Polycystin-2 (PC2)-Spiegel und schwächt das Zystenwachstum in Pkd1-Mutantenmodellen ab. Darüber hinaus verhindert eine akute pharmazeutische Blockade der Pkd1/2-cis-Hemmung das Auftreten von Zysten und stabilisiert etablierte PKD bei Mäusen. Schließlich zeigen wir, dass die Derepression von PKD1 oder PKD2 zystenpathogene Ereignisse in primären Nierenzystenepithelien von Personen mit ADPKD umkehrt.

Der Einfluss einzelner 3′-UTR-MBEs auf die Genregulation des Wirts ist weitgehend unerforscht. Wir untersuchten die Idee, dass die cis-Repression über das 3′-UTR-miR-17-Bindungsmotiv ein neuartiger Mechanismus ist, der die Pkd1-Dosierung steuert. Wir begannen mit der Untersuchung der Auswirkung der Löschung dieses MBE in normalen Mäusenieren. Wir haben sgRNAs entworfen, die an Pkd1-Exon-46 binden und das DNA-Segment flankieren, das das miR-17-Motiv kodiert, und mithilfe der CRISPR/Cas9-Bearbeitung Pkd1-Allele (Pkd1∆17) generiert, denen die miR-17-Bindungsstelle fehlt (Abb. 1a). . Zuerst validierten wir die Motivlöschung mittels DNA-PCR und anschließender direkter Sanger-Sequenzierung (Abb. 1b, c). Unser Bearbeitungsansatz hat Pkd1 nicht versehentlich inaktiviert, da wir bei 6 Wochen alten und 18 Wochen alten Pkd1∆17/∆17-Mäusen eine normale Nierenhistologie und Nierenfunktion beobachteten (Abb. 1d – f und ergänzende Abb. 1). Um die PC1-Spiegel zu bestimmen, führten wir eine Western-Blot-Analyse mit dem 7E12-PC1-Antikörper durch, der das Volllängenprotein und das n-terminale Fragment erkennt. Wir haben den 7E12-Antikörper zunächst in Wildtyp- und Pkd1-/--Zellen validiert. Wie erwartet beobachteten wir kein PC1-Signal in den Pkd1-Null-Zellen (ergänzende Abbildung 2). Trotz des Verlusts der miR-17-Bindungsstelle war die PC1-Expression in den Nieren von 6 Wochen alten oder 18 Wochen alten Pkd1∆17/∆17-Mäusen und ihren jeweiligen altersentsprechenden Kontroll-Pkd1+/+-Mäusen gleich ( Ergänzende Abbildung 1d), was darauf hindeutet, dass es in den Nieren normaler erwachsener Mäuse keine Pkd1-cis-Hemmung gab.

a Grafische Darstellung des CRISPR/Cas9-Ansatzes zur Löschung des miR-17-Motivs aus Pkd1 3′-UTR (Pkd1Δ17). b PCR-Produkte, die nach Amplifikation der Schwanz-DNA von Mäusen mit den angegebenen Genotypen erhalten wurden. Das untere Band repräsentiert die Δ17-Deletion. n = 3 für alle Genotypen. c 3′-UTR-Nukleotidsequenz von Wildtyp- (WT) und Pkd1Δ17-Allelen. Das miR-17-Bindungsmotiv und die sgRNA-PAM-Stellen sind in kräftigem Grün bzw. Rosa hervorgehoben. Die rosa gestrichelte Linie zeigt die gelöschten Nukleotide in Pkd1Δ17 an. Dargestellt ist ein Sanger-Sequenzierungschromatogramm, das die Nukleotidsequenz des Pkd1Δ17-Allels darstellt. d H&E-Färbung, Lotus Tetragonolobus-Lectin-Markierung (LTL, ein proximaler Tubulus-Marker), Tamm-Horsfall-Protein-Immunfärbung (THP, eine Henle-Schleife) und Dolichos Biflorus Agglutinin-Markierung (DBA, ein Sammelrohr-Marker), die eine normale Nierenhistologie zeigen 8 Wochen alte Pkd1+/+- und Pkd1Δ17/Δ17-Mäuse. e–f Normales Verhältnis von Nierengewicht zu Körpergewicht (KW/BW) und Serum-Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) bei 8 Wochen alten Pkd1+/+- und Pkd1Δ17/Δ17-Mäusen. g–h Bilder und Zystenindexquantifizierung von E13.5 Pkd1+/+-, Pkd1Δ17/+- und Pkd1Δ17/Δ17-Nieren, die vier Tage lang in Kulturmedien mit Vehikel, 100 μM cAMP oder 100 μM cAMP plus 250 μM SAM gezüchtet wurden. i Immunblots, die die PC1-Expression in Pkd1+/+-, Pkd1Δ17/+- und Pkd1Δ17/Δ17-Ex-vivo-Nieren zeigen, die mit Vehikel, cAMP oder cAMP plus SAM behandelt wurden. Als Ladekontrolle wird Aktin verwendet. j Allelspezifische qRT-PCR, die die Menge an Pkd1-mRNAs zeigt, die von den Wildtyp-(+)- und Δ17-Allelen in E15.5-Pkd1Δ17/+-Nieren (n = 5) produziert werden. Fehlerbalken zeigen SEM an. Statistische Analyse: Zweiseitiger Student-t-Test (e, f); Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest (h); Zweiseitiger gepaarter t-Test (j). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In Übereinstimmung mit den Beobachtungen anderer27 ergab die Analyse unseres miRNA-Microarray-Datensatzes, dass die miR-17-Spiegel mit der postnatalen Reifung sinken (ergänzende Abbildung 3). Daher ist das Fehlen der Pkd1-cis-Hemmung in reifen Nieren wahrscheinlich auf die niedrige basale miR-17-Aktivität zurückzuführen. Wir sind daher zur Analyse embryonaler (E) Pkd1∆17/+- und Pkd1∆17/∆17-Nieren übergegangen. Wir verwendeten eine Ex-vivo-Nierenorgankultur, um gleichzeitig die Auswirkungen auf die Pkd1-Expression und die Zystogenese zu bewerten. Wir kultivierten die Nieren der E13.5-Wurfgeschwister Pkd1+/+, Pkd1∆17/+ und Pkd1∆17/∆17 vier Tage lang in Medien, die 100 μM 8-Brom-cAMP oder 100 μM 8-Brom-cAMP plus S-Adenosylmethionin enthielten ( SAM) oder Fahrzeugsteuerung (Abb. 1g, h). Wie erwartet28 steigerte cAMP im Vergleich zur Vehikelbehandlung die Zystenbildung in Pkd1+/+-Nieren, und dieser Effekt wurde durch die Zugabe von SAM noch verstärkt. Interessanterweise war die prozystogene Wirkung von cAMP und SAM in den Nieren Pkd1∆17/+ und Pkd1∆17/∆17 abgeschwächt (Abb. 1g, h). Darüber hinaus beobachteten wir durch Immunoblot-Analyse eine höhere PC1-Expression in Pkd1∆17/+ und Pkd1∆17/∆17 im Vergleich zu ex vivo kultivierten Pkd1+/+-Nieren (Abb. 1i). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Deletion des miR-17-Motivs PC1 dereprimiert und die prozystogene Wirkung von cAMP in embryonal kultivierten Nieren blockiert.

Als nächstes haben wir die relative Häufigkeit von Wildtyp- und ∆17-Transkripten innerhalb des gesamten Pkd1-mRNA-Pools gemessen. Wir haben allelspezifische Primer entwickelt, die sich die einzigartige mRNA-Sequenz zunutze machen, die durch die CRISPR/Cas9-Bearbeitung des ∆17-Allels entsteht. qRT-PCR ergab, dass das ∆17-Allel in E15.5-heterozygoten in vivo Pkd1∆17/+-Nieren fast 50 % mehr Transkripte beisteuerte als sein Wildtyp-Gegenstück (Abb. 1j). In ähnlicher Weise stellten wir fest, dass das ∆17-Allel in Ex-vivo-Pkd1∆17/+-Nierenkulturen mehr Pkd1-mRNAs produzierte als das Wildtyp-Allel. Dieser Unterschied wurde in Gegenwart von cAMP noch deutlicher (ergänzende Abbildung 4a-c). Diese Beobachtungen deuten weiterhin auf eine Hemmung von Wildtyp-Pkd1-mRNAs durch miR-17, aber auf eine Umgehung der Repression und eine verbesserte Stabilität von Pkd1∆17-mRNAs in embryonalen Nieren hin.

Die Bildung von Nierenzysten erfolgt, wenn die PKD1-Dosierung unter einen kritischen Schwellenwert fällt. Es gibt jedoch keinen Ansatz, den PKD1-Rückgang umzukehren. Unsere Beobachtungen in normalen embryonalen Nieren veranlassten uns zu der Frage, ob Pkd1 bei ADPKD cis-reprimiert ist und ob die Verhinderung dieser Hemmung eine krankheitsmodifizierende Wirkung hat. Wir haben zunächst das zelluläre ADPKD-Modell Pkd1RC/− untersucht. Hierbei handelt es sich um eine aus Sammelrohren stammende Mauszelllinie, die die Missense-RC-Mutation auf einem Pkd1-Allel trägt, während das andere Allel inaktiviert ist29. Die RC-Mutation führt zu einer Substitution von Arginin durch Cystin zwei Aminosäuren vor der zweiten Transmembrandomäne und verringert die Menge an reifem (funktionellem) PC1-Protein. Die RC-Mutation ist auf Pkd1-Exon-30 abgebildet und liegt deutlich stromaufwärts des miR-17-Motivs, das von Pkd1-Exon-46 kodiert wird. Dadurch konnten wir mithilfe der CRISPR/Cas9-Bearbeitung das 3′-UTR-miR-17-Motiv aus dem RC-Allel (Pkd1RC∆17/−) entfernen (ergänzende Abbildung 5). Wir haben zwei unabhängige klonale Pkd1RC∆17/−-Zelllinien generiert und beide in Bezug auf die unbearbeiteten Elternzellen Pkd1RC/- und Pkd1RC/+ charakterisiert. Wir haben zuvor berichtet, dass die PC1-Expression in Pkd1RC/--Zellen im Vergleich zu Pkd1RC/+-Zellen verringert war. Bemerkenswerterweise ergab die Western-Blot-Analyse unter Verwendung des 7E12-Antikörpers, dass die Eliminierung des miR-17-Motivs die PC1-Expression in Pkd1RC∆17/–-Zelllinien wiederherstellte (Abb. 2a und ergänzende Abb. 7a). Anschließend haben wir mithilfe mehrerer unabhängiger Tests gezeigt, dass dieser Grad der PC1-Derepression ausreicht, um mehrere bekannte pathogene Ereignisse im Zusammenhang mit dem Zystenwachstum umzukehren. Erstens stellten wir eine höhere Proliferationsrate und 3D-Zystengröße in Pkd1RC/--Zellen fest als in Pkd1RC/+-Zellen, die nach PC1-Derepression in Pkd1RC∆17/--Zellen normalisiert wurden (Abb. 2b, c). Zweitens beobachteten wir, dass cAMP, Glucose und SAM zwar die bereits erhöhte Proliferation von Pkd1RC/--Zellen steigerten, Pkd1RC∆17/--Zellen jedoch gegen diese proliferativen Reize resistent waren (Abb. 2d und Ergänzungstabelle 1). Drittens verwendeten wir MitoTracker, um das mitochondriale Membranpotential als Proxy für die oxidative Phosphorylierung und die Immunfluoreszenz von Anti-pCreb1-Antikörpern als Anzeige für die c-AMP-Signalisierung zu bewerten. Im Vergleich zu Pkd1RC/+-Zellen beobachteten wir ein verringertes MitoTracker-Signal und eine höhere pCreb1-Expression in Pkd1RC/--Zellen. Das Gegenteil galt für Pkd1RC∆17/--Zellen, die ein wiederhergestelltes MitoTracker-Signal und eine verringerte pCreb1-Expression aufwiesen (Abb. 2e und ergänzende Abb. 6b). Schließlich ergab die Immunblot-Analyse eine erhöhte Yap1-, pCreb1- und c-Myc-Expression in Pkd1RC/--Zellen im Vergleich zu Pkd1RC/+-Zellen, die in Pkd1RC∆17/--Zellen auf den Ausgangswert zurückkehrte (ergänzende Abbildung 6c).

ein Immunblot, der eine verringerte PC1-Expression in Pkd1RC/- im Vergleich zu Pkd1RC/+-Zellen zeigt. Der PC1-Spiegel wurde in Pkd1RCΔ17/--Zellen wiederhergestellt. Nr. 1 und Nr. 2 beziehen sich auf die beiden unabhängigen klonalen Zelllinien Pkd1RCΔ17/-. Aktin dient als Ladekontrolle. n = 3 biologisch unabhängige Proben. b–c Repräsentative Bilder und Quantifizierung zeigen eine erhöhte 3D-Zystengröße von Pkd1RC/- im Vergleich zu in Matrigel kultivierten Pkd1RC/+-Zellen. Die Zystengröße war in Pkd1RCΔ17/--Zellen normalisiert. n = 300 Zysten, gepoolt aus drei unabhängigen Experimenten. d Heatmap, die die von AlamarBlue ermittelte Proliferation von Pkd1RC/-- und Pkd1RCΔ17/--Zellen in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von 100 μM cAMP, 17 mM Glucose oder 100 μM SAM zeigt. n = 8, jeder Kreis stellt ein biologisches Replikat dar. e Repräsentative Bilder, die Mito-Tracker-Markierung und Anti-pCreb1-Immunfärbung in Pkd1RC/+-, Pkd1RC/-- und Pkd1RCΔ17/--Zellen zeigen. n = 3 biologisch abhängige Experimente. f Bruttonieren- und H&E-gefärbte Nierenschnitte von 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen. Daten der Nachkommen der drei Gründer werden separat ausgewiesen. Gründer Nr. 1: Pkd1RC/+ (n = 7), Pkd1RC∆17/+ (n = 7), Pkd1RC/- (n = 8) und Pkd1RC∆17/- (n = 7). Gründer Nr. 2: Pkd1RC/+ (n = 15), Pkd1RC∆17/+ (n = 19), Pkd1RC/- (n = 15) und Pkd1RC∆17/- (n = 17). Gründer Nr. 3: Pkd1RC/+ (n = 6), Pkd1RC∆17/+ (n = 6), Pkd1RC/- (n = 8) und Pkd1RC∆17/- (n = 8). g Immunblot, der die PC1-Expression in den Nieren von 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen zeigt, die von den drei Gründern stammen. Aktin dient als Ladekontrolle. n = 3 unabhängige Nierenproben für jeden Genotyp und jeden Gründer. Dargestellt sind h, i KW/BW-Verhältnis und BUN-Spiegel bei Mäusen mit den angegebenen Genotypen. Es werden Daten aller drei Gründer angezeigt. Gründer Nr. 1 (blaue Kreise), Gründer Nr. 2 (hellrosa Kreise) und Gründer Nr. 3 (orange Kreise). (j) Paired-End-RNA-Seq-Daten, die die RC-Allelverwendung in Pkd1RC/- (graue Kreise, n = 5), Pkd1RCΔ17/- Founder#2 (rosa Kreise, n = 5) und Pkd1RCΔ17/- Founder#3 zeigen (orangefarbene Kreise, n = 5). Fehlerbalken zeigen SEM an. Statistische Analyse: Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest (c, h–j). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Basierend auf diesen ermutigenden Ergebnissen haben wir als nächstes die 3′-UTR ∆17-Deletionen in vivo modelliert. Wir haben KspCre+ CRISPR-bearbeitet; Pkd1RC/RC befruchtete Eier, um das miR-17-Motiv aus dem Pkd1 RC-Allel zu eliminieren. Wir implantierten diese Eier in pseudoschwangere weibliche Ersatzmäuse und erhielten schließlich drei keimbahnübertragende heterozygote KspCre+; Pkd1RC∆17/RC-Gründermäuse. Mithilfe von DNA-PCR und Sanger-Sequenzierung haben wir bestätigt, dass das miR-17-Motiv tatsächlich in allen drei Gründermäusen aus einem RC-Allel gelöscht wurde, während das andere RC-Allel immer noch das Wildtyp-3'-UTR enthielt (ergänzende Abbildung 8). Wir haben Mäuse mit heterozygoten ∆17-Deletionen ausgewählt, weil wir durch die Kreuzung mit Pkd1F/F-Mäusen die folgenden vier relevanten Genotypen aus demselben Zuchtpaar generieren konnten: Pkd1RC/F (Pkd1RC/+), Pkd1RC∆17/F (Pkd1RC∆17/ +), KspCre+; Pkd1RC/F (Pkd1RC/-) und KspCre+; Pkd1RC∆17/F (Pkd1RC∆17/-). Daten der 18 Tage alten Nachkommen aller drei Gründer sind in Abb. 2F – H dargestellt. Zunächst stellten wir eine normale Nierenhistologie und -funktion bei Pkd1RC∆17/+-Mäusen fest, was wiederum darauf hindeutet, dass die Deletion des miR-17-Motivs Pkd1 nicht stört oder PKD produziert (Abb. 2f). Für jeden Gründernachkommen beobachteten wir eine verringerte PC1-Expression, eine schwere zystische Nierenerkrankung, ein erhöhtes Verhältnis von Nierengewicht zu Körpergewicht (KW/BW) und höhere BUN-Spiegel im Serum bei Pkd1RC/--Mäusen als bei Pkd1RC/+-Mäusen (Abb. 2f–j). Wie bei den Zelllinien verursachte die Deletion des miR-17-Motivs eine PC1-Derepression, wie mithilfe des 7E12-Antikörpers in Pkd1RC∆17/--Nieren im Vergleich zu Pkd1RC/--Nieren beurteilt (Abb. 2g). Wir haben die PC1-Derepression in Zelllinien und Mäusen mithilfe eines zweiten unabhängigen Antikörpers überprüft, der vom U Maryland PKD Center generiert wurde (Einzelheiten siehe Methoden), der den PC1-C-Terminus erkennt (ergänzende Abbildung 7). Darüber hinaus stellten wir unter Verwendung von Paired-End-RNA-Seq eine höhere RC-Allelverwendung in Pkd1RC∆17/--Nieren als in Pkd1RC/--Nieren fest, was ein weiterer Hinweis auf eine Pkd1-Derepression ist (Abb. 2j). Bemerkenswerterweise wurde die zystische Erkrankung fast vollständig gelindert und KW/BW und Serum-BUN waren bei Pkd1RC∆17/-Mäusen im Vergleich zu Pkd1RC/--Mäusen nahezu normalisiert (Abb. 2f – i). Um die langfristigen Auswirkungen zu untersuchen, haben wir die Nachkommen der Gründer Nr. 2 und Nr. 3 acht bzw. 18 Wochen lang prospektiv verfolgt. Die Nachkommen von Gründer Nr. 2 zeigten einen aggressiven Phänotyp der zystischen Erkrankung, wobei 76, 4% (13/17) der Pkd1RC/–-Mäuse vor dem Alter von acht Wochen einem Nierenversagen erlagen (ergänzende Abbildung 9a, b). Darüber hinaus zeigten die vier überlebenden Pkd1RC/- Mäuse eine schwere PKD und ein fast tödliches Nierenversagen. Im Gegensatz dazu starben nur 27,2 % (6/22) der Pkd1RC∆17/–-Mäuse nach acht Wochen, und die überlebenden Mäuse hatten weniger Zysten und eine relativ erhaltene Nierenfunktion (ergänzende Abbildung 9c–e). Alle Gründer#3 Pkd1RC/--Nachkommen überlebten bis zum Alter von 18 Wochen. Sie entwickelten jedoch ein fortschreitendes Nierenversagen, was durch einen durchschnittlichen Harnstoffstickstoff (BUN) im Blut von >100 mg/dl und einen Serumkreatininwert von >0,4 mg/dl belegt wurde (Abb. 3b). Gründer Nr. 3 Pkd1RC∆17/- Mäuse zeigten ein minimales Fortschreiten der Krankheit mit einem durchschnittlichen BUN < 30 mg/dl und einem Serumkreatinin < 0,2 mg/dl (Abb. 3a, b).

a Brutto-Nierenbilder und H&E-gefärbte Nierenschnitte von 18 Wochen alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen, abgeleitet von Gründer Nr. 3. Die Deletion des miR-17-Motivs war mit einem anhaltenden Nutzen verbunden und unterdrückte das langfristige Fortschreiten der PKD. n = 3 (Pkd1RC/+), n = 3 (Pkd1RC∆17/+), n = 8 (Pkd1RC/-) und n = 7 (Pkd1RC∆17/-). b KW/BW, BUN und Serumkreatinin (Scr)-Spiegel bei den 18 Wochen alten Nachkommen von Gründer Nr. 3 werden angezeigt. c Heatmap, die globale mRNA-Expressionsprofile von Nieren von 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen zeigt. Für die Visualisierung wurden mRNAs ausgewählt, die in Pkd1RC/- im Vergleich zu Pkd1RC/+-Nieren fehlreguliert waren, in Pkd1RCΔ17/--Nieren jedoch eine verbesserte Expression zeigten. #3 = Gründer#3; #2 = Gründer#2. n = 3 (Pkd1RC/+), n = 3 (Pkd1RC∆17/+ Gründer 2), n = 3 (Pkd1RC∆17/+ Gründer 3), n = 5 (Pkd1RC/-), n = 5 (Pkd1RC∆ 17/- Gründer 2) und n = 5 (Pkd1RC∆17/- Gründer 3). (d) Repräsentative Bilder, die Phospho-Histon-H3 (pHH3), Mannose-Rezeptor C-Typ 1 (MRC1) oder pCreb1-Immunfärbung in Nierenschnitten von 18 Tage alten und 18 Wochen alten Pkd1RC/- (n = 5) zeigen ) und Pkd1RCΔ17/- (n = 5) Mäuse. Die Schnitte wurden gemeinsam mit DBA beschriftet, um aus dem Sammelrohr stammende Zysten zu markieren. Fehlerbalken zeigen SEM an. Statistische Analyse: Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest (b). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Eine großflächige transkriptomische Dysregulation, die Aktivierung der tubulären Proliferation und der onkogenen Signalübertragung sowie interstitielle Entzündungen sind einige der wichtigsten pathologischen Kennzeichen von ADPKD. Als nächstes untersuchten wir, ob diese Veränderungen durch die PC1-Derepression abgeschwächt wurden. Wir führten eine RNA-Seq-Analyse mit Nierenproben von 18 Tage alten Pkd1RC/+-, Pkd1RC∆17/+-, Pkd1RC/-- und Pkd1RC∆17/--Mäusen durch. Wir beobachteten eine Dysregulation eines umfangreichen Netzwerks von Gentranskripten mit einer Hochregulierung von 4157 und einer Herunterregulierung von 2067 mRNAs in zystischen Pkd1RC/- im Vergleich zu nichtzystischen Pkd1RC/+-Kontrollnieren (Abb. 3c). Pkd1RC∆17/+ spiegelte die Nierenhistologie wider und zeigte ein nahezu identisches Genexpressionsmuster wie Pkd1RC/+ Niere. Beeindruckenderweise zeigten >95 % der fehlregulierten mRNAs in Pkd1RC/--Nieren eine verbesserte (oder normalisierte) Expression in Pkd1RC∆17/--Nieren (Abb. 3c). In Übereinstimmung mit den RNA-seq-Daten ergab die Immunoblot-Analyse eine Verringerung von c-Myc und Yap1 in den Nieren von 18 Tage alten Pkd1RC∆17/--Mäusen im Vergleich zu Pkd1RC/--Mäusen (ergänzende Abbildung 9f). Schließlich zeigte die Immunfluoreszenzanalyse weniger Anti-Phospho-Histon-H3-positive Zellen, was auf eine geringere Proliferation hinweist, und verringerte Anti-pCreb1- und Anti-MRC1-Signale, was auf eine abgeschwächte c-AMP-Signalübertragung bzw. eine zystenassoziierte Entzündung in den Nieren von 18 Personen schließen lässt -Tage alte und 18 Wochen alte Pkd1RC∆17/- Mäuse im Vergleich zu Pkd1RC/- Mäusen (Abb. 3d).

Eine seit langem bestehende Frage ist, ob eine Erhöhung von PC2 einen niedrigen PC1 ausgleichen kann. Interessanterweise enthält PKD2, ähnlich wie PKD1, ein evolutionär konserviertes 3′-UTR-miR-17-Motiv. Unsere Arbeit weist auf eine erhöhte repressive Aktivität von miR-17 in Pkd1-mutierten ADPKD-Modellen hin. Daher haben wir uns gefragt, ob Pkd2 cis-inhibiert ist und ob sich die Verhinderung dieser Autoinhibition positiv auf das Fortschreiten der Krankheit in Pkd1-Mutantenmodellen auswirkt. Um diese Fragen zu beantworten, begannen wir erneut mit dem Pkd1RC/-Zellmodell, verwendeten dieses Mal jedoch CRISPR/Cas9, um die miR-17-Motive aus dem Pkd2 3′-UTR (Pkd1RC/-; Pkd2∆17/∆17) zu löschen Das Pkd1-miR-17-Motiv bleibt intakt (ergänzende Abbildung 10). In Übereinstimmung mit der 3′-UTR-cis-Hemmung beobachteten wir mithilfe von qRT-PCR und Immunoblot-Analyse eine höhere Pkd2- und PC2-Expression in zwei Pkd1RC/-; Klonale Zelllinien Pkd2∆17/∆17 im Vergleich zu ihren unbearbeiteten Elternzellen Pkd1RC/- (Abb. 4a). Die PC1-Expression blieb zwischen den bearbeiteten und nicht bearbeiteten Zellen unverändert, was auf die Spezifität der Deletion des miR-17-Motivs aus Pkd2 3'-UTRs hinweist (ergänzende Abbildung 11b). Überraschenderweise stellten wir fest, dass die PC2-Derepression mit einem verringerten 3D-Zystenwachstum, einem wiederhergestellten MitoTracker-Signal und einer Herunterregulierung der pCreb1-, Yap1-, Mettl3- und c-Myc-Expression in Pkd1RC/- verbunden war; Pkd2∆17/∆17-Zellen im Vergleich zu Pkd1RC/--Zellen (Abb. 4b-d und ergänzende Abb. 11b-c). Wie bei den Pkd1 3'-UTR-Deletionen stellten wir fest, dass dieser stimulierende Effekt bei Pkd1RC/- verloren ging, während cAMP, Glucose und SAM die Proliferation von Pkd1RC/--Zellen förderten; Pkd2∆17/∆17-Zellen (Abb. 4e, Ergänzungstabelle 2).

ein Immunblot, der die Polycystin-2 (PC2)-Expression in Zellen mit den angegebenen Genotypen zeigt. Die Deletion des miR-17-Motivs aus Pkd2 3′-UTR führt zu einer höheren PC2-Expression in Pkd1RC/--Zellen. Aktin dient als Ladekontrolle. #1 und #2 beziehen sich auf die beiden unabhängigen Pkd1RC/-; Pkd2Δ17/Δ17 klonale Zelllinien. n = 3 biologisch unabhängige Proben für beide Klone. b, c Repräsentative Bilder und Quantifizierung, die die 3D-Zystengröße von Zellen mit den angegebenen Genotypen zeigen, die in Matrigel-Kulturen gezüchtet wurden. n = 300 Zysten, gepoolt aus drei unabhängigen Experimenten. d Repräsentative Bilder, die Mitotracker-Markierung und Anti-pCreb1-Immunfärbung in Zellen mit den angegebenen Genotypen zeigen. n = 3 biologisch unabhängige Experimente. e Heatmap, die die von AlamarBlue ermittelte Proliferation von Pkd1RC/- und Pkd1RC/- zeigt; Pkd2Δ17/Δ17-Zellen in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von cAMP, Glucose oder SAM. n = 8, jeder Kreis stellt ein biologisches Replikat dar. f Gezeigt werden H&E-gefärbte Nierenschnitte von 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen. n = 3 (Pkd1RC/+; Pkd2+/+), n = 3 (Pkd1RC/+; Pkd2∆17/∆17), n = 8 Pkd1RC/-; Pkd2+/+) und n = 11 (Pkd1RC/-; Pkd2∆17/∆17). g Immunoblots, die die PC2-, Yap1- und c-Myc-Expression in den Nieren von 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen zeigen (n = 3 für jede Gruppe). h, i KW/BW und Serumkreatininspiegel bei 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen. j Repräsentative Bilder, die pHH3- und MRC1-Immunfärbung in Nierenschnitten von 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen zeigen (n = 3 für jede Gruppe). k Heatmap, die die unterschiedliche mRNA-Expression in den Nieren von 18 Tage alten Mäusen mit den angegebenen Genotypen zeigt (n = 3). mRNAs, die in Pkd1RC/- im Vergleich zu Pkd1RC/+-Nieren fehlreguliert waren, aber eine verbesserte Expression in Pkd1RC/- zeigten; Für die Heatmap-Visualisierung wurden Pkd2Δ17/Δ17-Nieren ausgewählt. Fehlerbalken zeigen SEM an. Statistische Analyse: Einfaktorielle ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest (b, h und i). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unsere Beobachtungen in Pkd1RC/--Zellen legen eine verlockende Möglichkeit nahe, dass die Verhinderung der Pkd2-cis-Hemmung und die Verbesserung der PC2-Expression das Fortschreiten der Krankheit in Pkd1-Mutantenmodellen kompensiert und verzögert. Wir haben diese Annahme in vivo getestet, indem wir das Pkd2 3′-UTR miR-17-Motiv (Pkd2∆17/∆17) in Pkd1RC/- Mäusen gelöscht haben. Kurz gesagt, wir haben KspCre mit CRISPR/Cas9 bearbeitet; Pkd1RC/RC-Mäuse zur Erzeugung von KspCre; Pkd1RC/RC; Pkd2∆17/+ Mäuse (Einzelheiten siehe ergänzende Abbildung 12). Diese Mäuse wurden dann mit Pkd1F/F-Mäusen gezüchtet, um schließlich die folgenden vier Genotypen zu erzeugen: (i) Pkd1RC/F; Pkd2+/+, (ii) Pkd1RC/F; Pkd2∆17/∆17, (iii) KspCre; Pkd1RC/F; Pkd2+/+ und (iv) KspCre; Pkd1RC/F; Pkd2∆17/∆17. Die Charakterisierung dieser Mäuse ergab, dass die Deletion des Pkd2-miR-17-Motivs in der nichtzystischen Umgebung keine Hochregulierung von PC2 verursachte, und dass sowohl Pkd1RC/F; Pkd2+/+ und Pkd1RC/F; Pkd2∆17/∆17-Mäuse zeigten eine normale Nierenhistologie und -funktion (Abb. 4f, g). Im Gegensatz dazu war die Deletion des Pkd2-miR-17-Motivs in zystischen Pkd1RC/--Mäusen mit einer höheren PC2-Expression verbunden. Darüber hinaus waren die KW/BW- und Serumkreatininspiegel bei Pkd1RC/- um 34,8 bzw. 25 % reduziert; Pkd2∆17/∆17 im Vergleich zu Pkd1RC/-; Pkd2+/+ Mäuse (Abb. 4h, i). Wir haben konsistent beobachtet, dass im Vergleich zu Pkd1RC/-; Pkd2+/+ Nieren, Pkd1RC/-; Pkd2∆17/∆17-Nieren zeigten eine verringerte c-Myc- und Yap1-Expression (Abb. 4G) sowie eine geringere Zystenproliferation und interstitielle Entzündung (Abb. 4j). Als zusätzliche phänotypische Charakterisierung führten wir eine RNA-seq-Analyse durch, um das transkriptomische Nierenprofil in den vier Mäusegruppen zu vergleichen (Abb. 4k). Die mRNA-Expressionsmuster waren in Pkd1RC/F nahezu identisch; Pkd2+/+ und Pkd1RC/F; Pkd2∆17/∆17, was weiter impliziert, dass die Eliminierung des Pkd2-miR-17-Motivs minimale Auswirkungen auf nichtzystische Nieren hat. Wie erwartet ist das zystische Pkd1RC/-; Pkd2+/+-Nieren zeigten im Vergleich zu nichtzystischen Pkd1RC/+-Nieren eine weit verbreitete mRNA-Dysregulation; Pkd2+/+ Kontrollnieren. Wir fanden heraus, dass die Deletion des Pkd2 miR-17-Motivs mit einer verbesserten Expression von fast 50 % dieser fehlregulierten mRNAs in Pkd1RC/- verbunden war; Pkd2∆17/∆17 (Abb. 4k).

Unsere CRISPR-editierten klonalen zellulären oder Maus-ADPKD-Modelle führen zu einer chronischen Pkd1- oder Pkd2-Derepression. Daher konnten wir nicht beurteilen, ob eine akute Derepression von Pkd1/2, gerade wenn sich die Zysten bilden, den Ausbruch der Krankheit verhindern wird oder ob die Wiederherstellung von Pkd1/2 bei bestehender PKD wirksam sein kann. Um diese Fragen zu beantworten, verwendeten wir das Anti-miR-17-Oligonukleotid RGLS4326 als Werkzeug zur akuten Blockierung der cis-Hemmung von Pkd1 und Pkd230. Zunächst haben wir bestätigt, dass RGLS4326 im Vergleich zu Vehikel (PBS) oder Kontrolloligonukleotid die Pkd1/2- und PC1/2-Expression in Pkd1RC/–-Zellen erhöhte (Abb. 5a, b). Die Pkd1/2-steigernde Wirkung von RGLS4326 zeigte sich innerhalb von drei Tagen nach der Behandlung. Wichtig ist, dass die Behandlung mit RGLS4326 nicht zu höheren PC1- und PC2-Spiegeln in Pkd1RC∆17/- und Pkd1RC/- führte; Pkd2∆17/∆17-Zelllinien bestätigen, dass die Hochregulierung von Polycystinen durch dieses Oligonukleotid auf dem miR-17-Motiv in Pkd1/2 3′-UTRs beruht (ergänzende Abbildung 14b – c). Mit RGLS4326 behandelte Pkd1RC/--Zellen hatten eine verringerte Proliferation, produzierten kleinere Zysten in 3D-Matrigel-Kulturen, zeigten eine geringere Yap1-, c-Myc- und pCreb1-Expression und ein höheres MitoTracker-Signal im Vergleich zu PBS- oder Kontroll-Oligonukleotid-behandelten Pkd1RC/--Zellen ( Ergänzende Abbildung 13). Die zystenreduzierende Wirkung von RGLS4326 war vorhanden, wurde jedoch bei Pkd1RC∆17/- oder Pkd1RC/- abgeschwächt; Pkd2∆17/∆17-Zelllinien, was darauf hindeutet, dass diese Verbindung ihre Vorteile in Pkd1RC/--Zellen hauptsächlich über die Pkd1/2-Derepression vermittelt (ergänzende Abbildung 14d-g). Als nächstes testeten wir die Auswirkung eines akuten Anstiegs von Pkd1/2 in Pkd1RC/--Zellen, nachdem sich bereits Zysten gebildet hatten. Wir haben unbehandelte Pkd1RC/--Zellen vier Tage lang in Matrigel kultiviert, damit die Zyste wachsen konnte. Anschließend behandelten wir diese Zysten mit einem Vehikel, einem Kontrolloligonukleotid oder RGLS4326 und überwachten sie drei weitere Tage lang. Die Größe der mit Vehikel und Kontroll-Oligonukleotiden behandelten Zysten verdreifachte sich nahezu, wohingegen die Behandlung mit RGLS4326 dieses Wachstum unterdrückte (Abb. 5c).

a–b qRT-PCR- und Immunoblot-Analyse, die die Pkd1/PC1- und Pkd2/PC2-Expression in Pkd1RC/--Zellen zeigt, die mit Vehikel (PBS), 100 μM Kontrolloligonukleotid oder 100 μM RGLS4326 transfiziert wurden. c Bilder und Quantifizierung der 3D-Zystengröße von Pkd1RC/--Zellen, die in Matrigel vor (Tag 4) oder nach (Tag 7) Transfektion mit Vehikel (PBS), 100 uM Kontrolloligonukleotid oder 100 uM RGLS4326 kultiviert wurden. d H&E-gefärbte Nierenschnitte von 18 Tage alten Pkd1RC/--Mäusen, denen P10, P11, P12 und P16 entweder mit Vehikel (PBS), 20 mg/kg Kontrolloligonukleotid oder 20 mg/kg RGLS4326 injiziert wurden. Als Referenz wird ein H&E-gefärbter Nierenschnitt einer unbehandelten 18 Tage alten Wildtyp-Maus gezeigt. Dargestellt sind z. B. KW/BW, BUN und Serumkreatininspiegel bei 18 Tage alten Pkd1RC/--Mäusen, die mit Vehikel (PBS), 20 mg/kg Kontrolloligonukleotid oder 20 mg/kg RGLS4326 behandelt wurden. Als Referenz werden Daten von unbehandelten 18 Tage alten Wildtyp-Mäusen gezeigt. h H&E-gefärbte Nierenschnitte von 26 Tage alten Pkd1RC/--Mäusen, denen auf P16 und P17 20 mg/kg Kontrolloligonukleotid oder 20 mg/kg RGLS4326 injiziert wurden. H&E-gefärbte Nierenschnitte von genetisch passenden, aber unbehandelten 16 Tage alten Pkd1RC/--Mäusen zeigen nachweislich eine Erkrankung vor Beginn der Behandlung. Dargestellt sind i–k KW/BW, BUN und Serumkreatininspiegel bei unbehandelten 16 Tage alten oder behandelten 26 Tage alten Pkd1RC/- Mäusen. l–n Pkd1RC/–-Mäusen wurde auf P16 und P17 Vehikel, 20 mg/kg RGLS4326 oder 20 mg/kg Kontrolloligonukleotid injiziert. Diese Mäuse erhielten dann bis zum Alter von 18 Wochen jede Woche ihr jeweiliges Behandlungsschema. Die vierte Kohorte von Pkd1RC/--Mäusen erhielt eine Behandlung mit 20 mg/kg RGLS4326 an P16, P17 und danach alle zwei Monate. l Gezeigt werden H&E-gefärbte Nierenschnitte von 125 Tage alten Pkd1RC/--Mäusen unter der Vehikel- oder RGLS4326-Behandlung. m Kaplan-Meir-Überlebenskurven von Pkd1RC/- Mäusen in den vier Behandlungsgruppen. Als Referenz wird das Überleben des unbehandelten Wildtyps gezeigt. n KW/BW-Verhältnis bei Mäusen, die bis zu 125 Tage überlebten. Wildtyp-Mäuse: n = 3; Pkd1RC/- Mäuse: n = 2 (Vehikelbehandlung), n = 5 (wöchentliche RGLS4326-Behandlung) und n = 7 (zweimonatliche RGLS4326-Behandlung). Fehlerbalken zeigen SEM an. Statistische Analyse: Einfaktorielle ANOVA, Mehrfachvergleichstest nach Tukey (a, c, e–g, i–k, n); Mantel-Cox (m). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Beobachtungen in Zellen in vivo reproduziert werden können. In der ersten Studie behandelten wir Pkd1RC/--Mäuse mit Vehikel (PBS), Kontroll-Oligonukleotid oder RGLS4326 ab P10, dem Alter, in dem sich in diesem Modell Zysten zu bilden beginnen. Bei P18 stellten wir bei PBS- und Kontroll-Oligonukleotid-behandelten Mäusen im Vergleich zu altersentsprechenden Wildtyp-Mäusen eine deutliche Nierenvergrößerung mit einem > 10-fach höheren KW/BW-Verhältnis und erhöhtem BUN und Serumkreatinin fest (Abb. 5d – g). Bemerkenswerterweise wurde PKD praktisch verhindert und die Nierenfunktion blieb bei mit P18 RGLS4326 behandelten Pkd1RC/–-Mäusen normal (Abb. 5d – g). In der zweiten Studie begannen wir mit der Behandlung bei P16, als Pkd1RC/--Mäuse bereits eine zystische Erkrankung entwickelt hatten. Bis P26 war eine von 15 mit Oligonukleotiden behandelten Kontrollmäusen gestorben, und die überlebenden Mäuse hatten eine fortschreitende Nierenvergrößerung und ein fast tödliches Nierenversagen entwickelt. Im Gegensatz dazu beobachteten wir eine Abschwächung des PKD-Fortschreitens und eine Stabilisierung der Nierenfunktion bei mit RGLS4326 behandelten Pkd1RC/--KO-Mäusen (Abb. 5h – k). Schließlich untersuchten wir in einer dritten Studie die langfristigen Auswirkungen der Pkd1/2-Derepression bei Mäusen, die bereits eine PKD entwickelt hatten. Wir behandelten Pkd1RC/--Mäuse auf P16 und P17 mit dem Vehikel, 20 mg/kg RGLS4326, oder 20 mg/kg Kontroll-Oligonukleotid. Diese Mäuse erhielten dann bis zum Alter von 18 Wochen jede Woche ihre jeweiligen Behandlungsschemata. Eine vierte Gruppe von Pkd1RC/--Mäusen erhielt eine Behandlung mit 20 mg/kg RGLS4326 an P16 und P17 und danach alle zwei Wochen. 85,7 % (12 von 14) der mit PBS behandelten und 100 % (14 von 14) der mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelten Pkd1RC/--KO-Mäuse erlagen ihrer Krankheit vor dem Alter von 18 Wochen. Im Gegensatz dazu überlebten 70 % (7 von 10) und 50 % (5 von 10) der Pkd1RC/–-Mäuse, die alle zwei Monate bzw. wöchentlich mit RGLS4326 behandelt wurden, bis zum Alter von 18 Wochen (Abb. 5m). Darüber hinaus stellten wir bei den überlebenden Mäusen in der RGLS4326-Gruppe ein im Wesentlichen erhaltenes Nierenparenchym (Abb. 5l und ergänzende Abb. 15) und ein verringertes KW/BW (Abb. 5n) fest. Somit schwächt eine akute pharmazeutische Pkd1/2-Derepression, auch nach Beginn der Zyste, die murine PKD ab.

Eine logische, aber entscheidende Frage ist, ob die PKD1/2-cis-Hemmung ein Merkmal der menschlichen ADPKD ist. Wir haben diese Zellen aus Zysten frisch entsorgter ADPKD-Nephrektomieproben von vier betroffenen Personen (drei Männer im Alter von 41, 48 und 52 Jahren und einer 57-jährigen Frau) gewonnen. Wir führten eine PKD1- und PKD2-Mutationsanalyse unter Verwendung von DNA aus Zystenzellen durch (ergänzende Abbildung 16). Die Zelllinien Nr. 1, Nr. 3 und Nr. 4 enthalten heterozygote PKD1-Mutationen, während Zelllinie Nr. 2 eine heterozygote, verkürzte PKD2-Mutation und eine Missense-heterozygote PKD1-Mutation enthält. Um das Translationspotenzial unserer Ergebnisse bei Mäusen zu bewerten, verwendeten wir die CRISPR/Cas9-Bearbeitung, um das PKD1- oder PKD2-miR-17-Motiv in diesen primären ADPKD-Kulturen zu eliminieren (ergänzende Abbildung 17). Wir haben menschenspezifische sgRNAs entworfen, die auf die miR-17-Motive in den PKD1- oder PKD2-3′-UTRs abzielen. Anschließend transfizierten wir primäre ADPKD-Kulturen aller vier Spender mit Cas9 und entweder PKD1- oder PKD2-3′-UTRs-sgRNAs. Scheintransfizierte Zellen von jedem Spender dienten als unbearbeitete Elternkontrollen. Wir stellten innerhalb von drei Tagen nach der Modellierung des PKD1∆17-Allels in allen vier CRISPR-transfizierten Kulturen im Vergleich zu ihren jeweiligen scheintransfizierten Elternkontrollen höhere PC1-Werte fest (Abb. 6a). In ähnlicher Weise führte die Modellierung von PKD2∆17-Allelen zu einer höheren PC2-Expression in CRISPR-transfizierten Kulturen als in ihren jeweiligen scheintransfizierten Elternkontrollen (Abb. 6b). Als nächstes bewerteten wir die funktionelle Bedeutung der PKD1- oder PKD2-Derepression durch die Durchführung von Matrigel-3D-Zystogenese, AlamarBlue-Proliferationstests, MitoTracker-Markierung lebender Zellen und Anti-pCREB1-Immunfluoreszenz. Die CRISPR-transfizierten Kulturen, die PKD1∆17- oder PKD2∆17-Zellen enthielten, bildeten kleinere Zysten (Abb. 6c – f) und zeigten niedrigere Proliferationsraten (ergänzende Abb. 18), ein höheres MitoTracker-Signal und eine geringere pCREB1-Expression im Vergleich zu ihren jeweiligen Scheinkulturen. transfizierte, unbearbeitete Kontrollen (Abb. 6g, h). Diese Daten deuten auf eine anhaltende cis-Hemmung von PKD1/2 hin und belegen den potenziellen Nutzen einer Derepression von PKD1/2 in menschlichen ADPKD-Zellen

CRISPR/Cas9-Editierung wurde verwendet, um das miR-17-Motiv aus PKD1 3′-UTR (PKD1Δ17) oder PKD2 3′-UTR (PKD2Δ17) in primären ADPKD-Kulturen von vier menschlichen Spendern (Nr. 1 bis Nr. 4) zu löschen. a, b Immunoblots, die eine höhere PC1-Expression in PKD1Δ17- und eine höhere PC2-Expression in PKD2Δ17-ADPKD-Kulturen im Vergleich zu ihren jeweiligen unbearbeiteten (UE) parentalen ADPKD-Kulturen zeigen. Die Proteinbanden sind 460 kDa (a) und 110–120 kDa groß (b). Aktin dient als Ladekontrolle. c–f Bilder und Quantifizierung zeigen eine verringerte Zystengröße von PKD1Δ17 und PKD2Δ17 im Vergleich zu ihren jeweiligen unbearbeiteten (UE) parentalen ADPKD-Kulturen. g, h Bilder, die eine höhere Mitotracker-Markierung (rot) und eine verringerte pCREB1-Immunfärbung (grün) in PKD1Δ17- und PKD2Δ17-ADPKD-Kulturen im Vergleich zu ihren jeweiligen unbearbeiteten ADPKD-Elternkulturen zeigen. n = 3 biologisch unabhängige Experimente für jede Zelllinie. Fehlerbalken stellen SEM dar, statistische Analyse: Zweiseitiger Students-T-Test (e, f). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der heterozygote PKD1-Funktionsverlust als genetische Ursache von ADPKD wurde vor über 25 Jahren entdeckt31,32,33, Ansätze zur Wiederherstellung der PKD1-Expression sind jedoch noch nicht bekannt. In dieser Arbeit stellen wir einen praktikablen Rahmen für die Erhöhung der endogenen PKD1-Spiegel bereit und zeigen zum ersten Mal, dass die monoallele Pkd1-Derepression ausreicht, um die präklinische PKD zu lindern.

Eine einheitliche und sparsame Erklärung für den Ausbruch von ADPKD ist, dass die Zystogenese erfolgt, wenn die funktionelle PKD1-Dosis um 70–80 % abfällt und unter einen kritischen Schwellenwert fällt3. Daher kann die Keimbahninaktivierung eines PKD1-Allels allein dieses Ausmaß der Dosisreduktion nicht erklären. Zusätzliche stochastische Ereignisse, die das verbleibende Allel unterdrücken, sind erforderlich und spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Krankheitsausbruchs. In diesem Zusammenhang haben wir entdeckt, dass die miR-17-vermittelte ineffiziente Translation von mRNAs, die vom nicht inaktivierten PKD1-Allel transkribiert werden, einen zielgerichteten, somatischen inhibitorischen ADPKD-Auslösemechanismus darstellt. Als attraktives Sicherheitsmerkmal scheint die Pkd1-Hemmung durch miR-17 ein ADPKD-spezifisches Phänomen zu sein, da wir beobachtet haben, dass der miR-17-Spiegel in normalen erwachsenen Mäusenieren niedrig ist und daher keinen Einfluss auf die Pkd1-mRNA-Stabilität in der Niere hat nicht-zystische Einstellung. Im Gegensatz dazu wird die miR-17-miRNA-Familie in PKD-Modellen aktiviert, wo sie offenbar die Pkd1-Repression bis weit ins Erwachsenenalter hinein vermittelt, was durch die Abschwächung des Zystenwachstums durch das Anti-miR-17-Medikament RGLS4326 belegt wird, selbst wenn die Behandlung begonnen wird in späteren Stadien der Krankheit. Ein bemerkenswerter Vorbehalt besteht darin, dass RGLS4326 zwar die PC1-Spiegel erhöht, seine Vorteile in späteren Krankheitsstadien jedoch aus der gleichzeitigen Derepression anderer miR-17-Ziele, einschließlich PC2 und Ppara, abgeleitet werden könnten. Eine weitere Erkenntnis aus unserer Arbeit ist, dass die potenzielle Wiederherstellung hypomorpher Pkd1-Mutanten ein vorteilhafter therapeutischer Ansatz sein könnte. Vorsicht ist geboten, insbesondere bei Modalitäten, bei denen eine exogene PKD1-Supplementierung zum Einsatz kommt: Eine Erhöhung von Pkd1 über die Wildtyp-Werte führt bei Mäusen zu einer zystischen Erkrankung34,35. Die Einzigartigkeit unserer Methode besteht jedoch darin, dass sie nicht auf der Transaktivierung, sondern auf der Verhinderung der Hemmung beruht, was es unwahrscheinlich macht, dass PKD1 in den supratherapeutischen Bereich aufsteigt. Als Zeichen dafür, dass die miR-17-vermittelte PKD1-Hemmung sogar bei Personen mit ADPKD relevant sein könnte, stellten wir fest, dass die Löschung des PKD1-miR-17-Motivs in primären menschlichen ADPKD-Kulturen PC1 erhöht und das Wachstum und die Proliferation von 3D-Zysten verringert. In ähnlicher Weise erhöht die Hemmung von miR-17 die PC1-Spiegel und hemmt das Zystenwachstum und die Proliferation primärer menschlicher ADPKD-Kulturen4,30. Als weiterer Beweis zeigte eine kürzlich durchgeführte klinische Studie der Phase 1b, dass die Behandlung mit RGLS4326 mit höheren PC1-Werten im Urin bei ADPKD-Patienten verbunden ist36. Weitere klinische Studien mit dem Anti-miR-17-Oligo RGLS8429 der nächsten Generation sind geplant.

Unsere Studien klären auch die Rolle von PKD1 bei der kontinuierlichen Expansion und dem Wachstum von Nierenzysten. Zusammen mit der Zysteninitiierung löst die PKD1-Hemmung eine weitreichende transkriptomische und metabolische Dysregulation aus und aktiviert zahlreiche onkogene Signalwege, wie z. B. cAMP und c-Myc/Yap4,37,38,39,40,41,42,43,44,45. Man geht wiederum davon aus, dass diese nachgeschaltete zystenpathogene Signalübertragung die Zystenexpansion vorantreibt. Trotz dieser weit verbreiteten Fehlregulation wurde in einer kürzlich durchgeführten eleganten Studie berichtet, dass die Rekonstitution von transgenem Pkd1 oder Pkd2 die etablierte zystische Erkrankung bei Mäusen schnell umkehrt46. Wir fanden übereinstimmend heraus, dass eine akute Pkd1/2-Derepression bei etablierten zystischen Erkrankungen vorherrscht und Pkd1-mutierte Zellen resistent gegen prozystogene Reize wie cAMP und SAM macht. Diese Beobachtungen deuten insgesamt darauf hin, dass PKD1 der primäre, wenn nicht der einzige Faktor ist, der die Entstehung und das Wachstum von Zysten steuert.

Wir berichten über einen unerwarteten Befund, dass Pkd2 den zystischen Phänotyp von Pkd1-Mutantenmodellen beeinflusst. PC1 und PC2 interagieren physikalisch und werden an mehreren subzellulären Stellen koexprimiert, was darauf hindeutet, dass die beiden Proteine ​​auf demselben physiologischen Weg funktionieren47,48,49,50. Wir fügen eine neue Dimension hinzu, indem wir diese Beziehung auf den pathologischen Kontext erweitern. Möglicherweise kann die Verbesserung der Pkd2-Expression in Pkd1-mutierten Zellen den PC1-Handel verbessern und/oder heteromerere PC1-PC2-Proteinkomplexe bilden.

Schließlich liefert unsere Arbeit neue Einblicke in die miRNA-Biologie. Es ist bekannt, dass miRNAs gleichzeitig, aber subtil, große mRNA-Netzwerke unterdrücken. Unser Ansatz entkoppelt und entwirrt diese Pleiotropie im Kontext der PKD. Wir haben ein System entwickelt, bei dem die Bindung von miR-17 an Pkd1 (oder Pkd2) verhindert wird, während seine Fähigkeit zur Interaktion mit seinen anderen mRNA-Zielen intakt bleibt. Bemerkenswerterweise führt die Eliminierung nur eines 3′-UTR-miR-17-Motivs zu den Auswirkungen der Hemmung des gesamten miR-17 in Pkd1RC/--Modellen. Somit ist unsere Arbeit eine der ersten, die zeigt, dass unter bestimmten Umständen der Großteil der biologischen Wirkung einer miRNA durch die Unterdrückung einer Handvoll ihrer Ziele erzielt werden kann. Es gibt einige Parallelen zwischen unserer Arbeit und der Infektionsachse miR-122 – Hepatitis C (HCV), was die Bekämpfung der krankheitszentralen RNA betrifft. Der miR-122-Mechanismus ist jedoch unkonventionell, da er auf das fremde HCV-RNA-Genom abzielt, die 5′-UTR bindet und die HCV-Akkumulation unterstützt51,52.

Die meisten miRNAs sind für homöostatische Gewebefunktionen entbehrlich und können relativ einfach pharmazeutisch gehemmt werden. Trotz dieser positiven Eigenschaften hinkt die miRNA-basierte Arzneimittelentwicklung im Vergleich zu anderen Formen von RNA-Therapeutika hinterher53. Dies liegt zum Teil daran, dass der pleiotrope molekulare Mechanismus zahlreicher nachgeschalteter mRNA-Ziele es schwierig macht, die biologische Wirkung von miRNA zu validieren oder pharmakodynamische Messwerte für Anti-miRNA-Medikamente zu entwickeln. Wir argumentieren, dass die Priorisierung von miRNAs, die als tonische Inhibitoren einer Handvoll krankheitszentraler mRNAs fungieren, wahrscheinlich eine fruchtbare Strategie für die Arzneimittelentwicklung ist. Wichtig ist, dass unsere Erkenntnisse übertragbar sind und wir spekulieren, dass ähnliche Formen der therapeutisch gezielten cis-hemmenden Regulation bei anderen Erkrankungen existieren, insbesondere bei haploinsuffizienten monogenetischen Erkrankungen.

Wir haben die miR-17-Bindungsstelle mithilfe von CRISPR/Cas9 aus der 3′-UTR von Pkd1 oder Pkd2 gelöscht. Wir haben sgRNAs mithilfe von www.benchling.com entworfen und die Sequenzen bei IDT bestellt. Das sgRNA-Paar zielte auf DNA-Sequenzen vor und nach dem miR-17-Motiv in den Pkd1- oder Pkd2-Genen. Wir haben die sgRNAs in den CRISPR-Säugetier-Expressionsvektor pSpCas9(BB)−2A-GFP54 kloniert. Unter Verwendung dieser sgRNA-kodierenden Plasmide haben wir die Zelllinie Pkd1RC∆17/- und die Zelllinie Pkd1RC/- generiert. Pkd2∆17/∆17-Zelllinie wie unten beschrieben. Um die Pkd1RC∆17/--Zelllinie zu erzeugen, transfizierten wir Pkd1RC/--Zellen mit 0,6 µg des SpCas9-2A-GFP-Plasmids, das die Upstream- oder Downstream-sgRNA trägt, unter Verwendung von Lipofectamine 3000. Nach 72 Stunden führten wir FACS durch, um GFP- auszuwählen. positive Zellen mit der höchsten Intensität von 5 %. Diese Zellen wurden in 96-Well-Platten einer klonalen Expansion unterzogen. Gut gebildete Kolonien wurden durch DNA-PCR der angestrebten Pkd1-Genomsequenz auf das Fehlen der miR-17-Bindungsstelle untersucht. Klone mit erwarteten Deletionsbanden wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt. Zwei klonale Pkd1RC∆17/--Zelllinien mit bestätigten Deletionen wurden zusammen mit ihren Elternkontrollzelllinien weiter charakterisiert und analysiert, wie in Abb. 2 und der ergänzenden Abb. 4 dargestellt. Wir verwendeten dieselbe Strategie und denselben experimentellen Ansatz zur Erzeugung der beiden Pkd1RC /-; Pkd2∆17/∆17-Zelllinien (Abb. 4 und ergänzende Abb. 8). Die sgRNA-Sequenzen und Genotypisierungsprimer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Die folgenden Mäusestämme wurden verwendet: (1) für die in Abb. 1 gezeigten Mausmodelle wurden weibliche und männliche Wildtyp-C57BL/6-N-Mäuse verwendet; (2) für die in den Abb. gezeigten Mausmodelle. 2 und 4 haben wir KspCre verwendet; Pkd1RC/RC-Mäuse, die von unserem Labor auf einem C57BL/6 J-Hintergrund gehalten wurden. Präpubertäre weibliche Mäuse unterzogen sich einer Superovulation unter Verwendung einer Standard-Hormontherapie. Der Nebenhoden wurde männlichen Mäusen zur Spermienernte entnommen. Nach der In-vitro-Fertilisation wurden einzellige befruchtete Eizellen isoliert. CRISPR-Reagenzien (IDT) wurden durch Elektroporation unter Verwendung eines Nepa21 Super Electroporator (NEPAGENE, Ichikawa, Japan) an das Zytoplasma abgegeben. Die Eier, die die Elektroporation überlebten, wurden gewaschen und in frischen M16-Medien in Mikrotropfenkulturen kultiviert. Die Eier wurden dann chirurgisch in die Eileiter von am ersten Tag pseudoschwangeren ICR-Weibchen übertragen. Im Alter von 21 Tagen wurden Gründermäuse durch Genotypisierung auf Deletion der miR-17-Bindungsstelle untersucht und die Deletion durch Sanger-Sequenzierung bestätigt.

In dieser Studie wurden KspCre-, Pkd1F/F- und Pkd1RC/RC-Mäuse verwendet4,24,30,55. Alle Mäuse wurden auf einem C57BL/6 J-Hintergrund gehalten. Zu festgelegten Zeitpunkten wurden die Mäuse nach einem genehmigten Protokoll anästhesiert und Blut wurde über eine Herzpunktion entnommen. Die rechte Niere wurde gewogen, um das KW/BW-Verhältnis zu ermitteln, und sofort für zukünftige molekulare Analysen schockgefroren. Die linke Niere wurde mit eiskaltem 1X PBS und 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd perfundiert. Anschließend wurde die Niere in Paraffin eingebettet. Alle Studien verwendeten die gleiche Anzahl von Männern und Frauen. Das UT Southwestern Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte alle Tierversuche.

Pkd1RC/+ und Pkd1RC/- sind isogen und sammeln aus Milchgängen stammende Epithelzelllinien. Diese Zellen wurden aus den Nieren einer 14 Tage alten männlichen Pkd1RC/flox-Maus erzeugt. Eine Einzelzellsuspension wurde durch Zerkleinern des Nierengewebes in 1-mm-Würfel und anschließende 40-minütige Inkubation in DMEM mit 5 % Kollagenase (Sigma #C1639, USA) bei 37 °C unter intermittierendem Rühren hergestellt. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang mit biotinyliertem Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA, ein Sammelrohrmarker) (Vector Labs #B-1035) inkubiert. DBA-positive Zellen wurden mit einem CELLection Biotin-Binder-Kit (Invitrogen #11533D) isoliert. Anschließend wurden die Zellen mit dem SV40 T Antigen Cell Immortalization Kit (Alstem #CILV01) immortalisiert. Ein SV40-positiver, immortalisierter Pkd1RC/Flox-Klon wurde mit einem Adenovirus infiziert, das Cre-Rekombinase exprimiert (Vector Biolabs #1779), um das floxierte Allel zu löschen und dadurch die Pkd1RC/--Zellen zu erzeugen. Die Rekombination des Floxed-Allels wurde durch Genotypisierung bestätigt. Als Kontrolle dient der nicht infizierte Elternklon mit dem Genotyp Pkd1RC/+ (wobei das „+“ für das floxierte Allel steht). Diese Zellen werden in einem epithelialen Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium/Ham's F-12-Medium, ergänzt mit 2 % fötalem Rinderserum, Insulin (8,3 × 10–7 m), Prostaglandin E1 (7,1 × 10–8 m) und Selen gehalten (6,8 × 10-9 m), Transferrin (6,2 × 10-8 m), Trijodthyronin (2 × 10-9 m), Dexamethason (5,09 × 10-8 m) und rekombinantes γ-Interferon (10 Einheiten/ml) bei 37 °C.

Pkd1+/+- und Pkd1-/--Zellen sind isogene, aus Nierentubuli stammende Epithelzelllinien. Diese Zellen wurden aus den Nieren eines 12 Tage alten männlichen Pkd1F/F-Mauswelpen erzeugt. Die Nieren wurden isoliert und in 1 mm große Würfel zerkleinert. Das Gewebe wurde 40 Minuten lang in DMEM mit 5 % Kollagenase (Sigma #C1639, USA) bei 37 °C unter intermittierendem Rühren inkubiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Die Zellen wurden dann mit einem 40-Mikrometer-Zellsieb abgesiebt und mit biotinyliertem Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA) (Vector labs #B-1035) 1 Stunde lang inkubiert. DBA-positive Zellen wurden mit einem CELLection Biotin-Binder-Kit (Invitrogen #11533D) isoliert. Anschließend wurden die Zellen mit dem SV40 T Antigen Cell Immortalization Kit (Alstem #CILV01) immortalisiert und durch klonale Expansion kultiviert. Die Klone wurden mittels Genotypisierung auf SV40 auf den SV40-Marker untersucht und ein Klon für die weitere Kultur ausgewählt. Pkd1-/--Zellen wurden durch Infektion der Pkd1F/F-Zellen mit einem Adenovirus erzeugt, das Cre-Rekombinase exprimiert (Vector Biolabs #1779), sodass die floxierten Allele ablatiert werden. Infizierte Zellen wurden durch klonale Expansion kultiviert. Die Klone wurden genotypisiert, um die erfolgreiche Rekombination und Deletion beider Pkd1-Allele zu bestätigen. Die Eltern-Pkd1F/F- und die Pkd1-/--Zellen wurden durch qRT-PCR und Western-Blot-Analyse weiter charakterisiert (ergänzende Abbildung 2). Diese Zellen werden in einem Epithelzellkulturmedium gezüchtet und gehalten, wie im obigen Abschnitt beschrieben.

Das Einbetten des Gewebes in Paraffin und das anschließende Schneiden wurden unter Verwendung von Standardprotokollen vom Histology Core am UT Southwestern Medical Center durchgeführt. Die Gewebe wurden in 5-µm-Schnitte geschnitten und zur histologischen Analyse mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt. Die gefärbten Abschnitte wurden mit einem Objektträgerscanner abgebildet.

Für die Gesamt-RNA-Extraktion wurde ein Qiagen miRNEASY-Kit verwendet. cDNA wurde mit einem Invitrogen First Strand Superscript III cDNA-Synthesekit hergestellt. Q-PCR wurde mit iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) durchgeführt. Alle Proben wurden in doppelter oder dreifacher Ausfertigung auf das CFX ConnectTM Echtzeit-PCR-Nachweissystem geladen. 18s wurde verwendet, um die mRNA-Expression zu normalisieren. Die Sequenzen der Primer sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt.

Das Gesamtprotein wurde aus Nieren oder Zellen unter Verwendung eines Lysepuffers isoliert, der durch Mischen von T-PER-Gewebeprotein-Extraktionsreagenz (Invitrogen, Katalog-Nr. 78510) mit einer Protease-Phosphatase-Inhibitor-Tablette (Fisher, Katalog-Nr. PIA32961) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde. Der Lysepuffer wurde hergestellt und als einmalige Aliquots bei –80 °C gelagert. Die Aliquots wurden unmittelbar vor der Proteinisolierung auf Eis aufgetaut. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bradford Assay-Reagenz gemessen. Proteinproben wurden in 4X NuPAGE LDS Sample Buffer mit 0,5 % b-Mercaptoethanol (Sigma, Katalog-Nr. M6250) für alle Proteine ​​vorbereitet, mit Ausnahme von PC1 und PC2 und deren Ladungskontroll-Beta-Actin, die mit 0,1 M DTT (Sigma, Katalog) hergestellt wurden # D0632). Die Proben wurden vor der Gelelektrophorese immer frisch vorbereitet. BME-Proben wurden 5 Minuten lang bei 98 °C gekocht, bevor sie auf Gele aufgetragen wurden. Die DTT-Proben wurden 10 Minuten lang bei 25 °C inkubiert, bevor sie auf Gele aufgetragen wurden.

Für den PC1-Nachweis in voller Länge wurden die Proben 1,5 Stunden lang auf dem NuPAGE™ 3–8 % Tris-Acetat-Proteingel (Invitrogen, EA03785) bei 160 V auf Eis laufen gelassen. In jedem Gel wurde eine Proteinleiter mit hohem Molekulargewicht (Invitrogen, Katalognummer LC5699) verwendet, um 460-kDa-Proteine ​​zu verfolgen. Elektrophoretisch getrennte Proteine ​​wurden mit dem Invitrogen-Transfersystem bei 200 mA für 100 Minuten auf Eis oder bei 4 °C übertragen. Die Proben mit 10 µg Protein wurden auf Mini-PROTEAN SDS-Polyacrylamid-Fertiggelen laufen gelassen, um andere Proteine ​​nachzuweisen. In jedem Gel wurde eine Standard-Molekulargewichtsleiter verwendet, um die Proteingrößen zu verfolgen. Die Gele wurden bei 150 V betrieben, bis der Farbstoff aufgebraucht war. Die Proteine ​​wurden mit dem Trans-Blot Semi-Dry Transfer System im gemischten MW-Programm auf eine Nitrozellulosemembran übertragen.

Nach Abschluss des Transfers wurden die Membranen mit 5 % fettfreier Milch blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern sondiert. Die Membranen wurden am nächsten Morgen dreimal mit 1x TBS-Tween gewaschen, vor und nach einer einstündigen Sondierung mit einem sekundären Antikörper. Als sekundärer Antikörper wurde Ziege-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-HRP-konjugiertes IgG verwendet. HRP-konjugierter Aktin-Antikörper (Sigma, Katalog-Nr. a3854) wurde zur Messung des Gesamtproteins verwendet. Die Blots wurden unter Verwendung des Chemilumineszenzsubstrats SuperSignal West Dura, ECL oder Femto von Pierce entwickelt. Die Blots wurden mit dem digitalen Imager von Bio-Rad entwickelt. Die Proteinbanden wurden mit der Imagelab-Software von Bio-Rad quantifiziert. Jeder Western Blot wurde mindestens dreimal wiederholt. Zehn Mikrogramm Protein aus Zellen oder Nieren wurden auf Gelen laufen gelassen, um Proteine ​​< 150 kDa nachzuweisen. 40–60 µg Protein wurden auf Gelen laufen gelassen, um PC1-Protein voller Länge mit hohem Molekulargewicht (462 kDa) nachzuweisen. Alle primären Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet, mit Ausnahme von PC1 (verwendet in einer Verdünnung von 1:500), und die sekundären Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:5000 verwendet. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: PC1 (7E12 Santa Cruz, Katalognummer sc-130554); PC1 E8-8C3C10 (Baltimore PKD-Kernzentrum), PC2 (Geschenk des Baltimore PKD-Kerns); pCREB (Cell Signaling, Katalognummer 9198); c-Myc (Abcam, Katalog-Nr. ab185656), YAP1 (Cell Signaling, Katalog-Nr. 4912); Mettl3 (Invitrogen, Katalognummer MA5-27527).

Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden Paraffinschnitte von Nierengewebe verwendet. Kurz gesagt, die Objektträger wurden entparaffiniert, indem sie zunächst 1 Stunde lang bei 60 °C gebacken und dann dreimal jeweils 5 Minuten lang in Histo-clear (Fisher, HS-2001) gewaschen wurden. Anschließend wurden die Objektträger vor der Inkubation in 1X PBS durch Waschen mit 100 %, 95 % und 70 % Ethanol rehydriert. Anschließend wurden die Objektträger einer Antigengewinnung mit Natriumcitrat unterzogen. Die Objektträger wurden 40 Minuten lang mit Natriumborhydrid behandelt, um die Autofluoreszenz zu löschen. Die Objektträger wurden dreimal in 1X PBS gewaschen und dann in 1X PBS + 10 % Ziegenserum + 0,1 % BSA (Antikörperblock) für mindestens 1–2 Stunden bei RT blockiert. Die Schnitte wurden über Nacht mit Primärantikörpern inkubiert. Primärantikörper wurden mit Antikörperblock in einer Verdünnung von 1:500 verdünnt. Die Objektträger wurden dreimal jeweils 5 Minuten lang in 1X PBS gewaschen, 1 Stunde lang mit Alexa Fluor-Sekundärantikörpern (verdünnt unter Verwendung des Antikörperblocks auf eine Verdünnung von 1:500) behandelt und dann dreimal jeweils 5 Minuten lang gewaschen. Die Objektträger wurden mit Vecta Shield mit Dapi montiert. Die Objektträger wurden mit dem Zeiss Compound Light-Mikroskop oder dem Zeiss Axioscan Z1-Objektträgerscanner abgebildet. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: DBA (Vector Labs, Katalog-Nr. B-1035), THP (Biomedical Technologies, Katalog-Nr. BT-590), LTA (Vector Labs, Katalog-Nr. B-1325), MRC1 (Abcam, Katalog-Nr. ab64693) , pCREB1 (Cell Signaling, Katalognummer 9198) und pHH3 (Sigma, Katalognummer H0412). Verarbeitung, Immunfärbung und Bildgebung der Objektträger wurden in jedem Experiment gleichzeitig durchgeführt.

Eine Immunfluoreszenzfärbung wurde an Zellen durchgeführt, die auf Objektträgern mit 8 Kammern gezüchtet wurden (Fisher, Katalog-Nr. 154534PK). Die Zellen wurden mit 100 % eiskaltem Methanol 5 Minuten lang bei 4 °C fixiert. Die Objektträger wurden dreimal 5 Minuten lang mit 1X PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 1X PBS + 10 % Ziegenserum + 0,1 % BSA + 0,1 M Glycin + 0,1 % Tween 20 (Antikörperblock) für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Primärantikörper wurden mit Antikörperblock in einer Verdünnung von 1:100 verdünnt und 2 Stunden lang auf die Objektträger gegeben. Die Objektträger wurden dreimal jeweils 5 Minuten lang in 1X PBS gewaschen, 1 Stunde lang mit Alexa Fluor-Sekundärantikörpern (verdünnt unter Verwendung des Antikörperblocks auf eine Verdünnung von 1:500) behandelt und dann dreimal jeweils 5 Minuten lang gewaschen. Die Objektträger wurden 10 Minuten lang in DAPI (Fisher, Katalognummer ICN15757410) gegengefärbt, 1:10.000 in destilliertem Wasser verdünnt, bevor sie unter einem Zeiss Compound Light-Mikroskop abgebildet wurden. Für jedes Experiment wurden die Kontroll- und Behandlungszellen oder die Kontroll- und die ∆17-Zellen gleichzeitig in verschiedenen Kammern desselben Objektträgers ausgesät. Gleichzeitig wurden auch Verarbeitung, Immunfärbung und Bildgebung der Objektträger durchgeführt.

MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher, Katalognummer M7512) wurde zur Analyse des mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen verwendet. Das lyophilisierte MitoTracker®-Produkt wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 1 mM gelöst und in kleinen Aliquots bei –20 °C gelagert. Bis zu einer Konfluenz von 40–70 % gewachsene Zellen wurden mit sterilem PBS gewaschen und dann 8 Minuten lang mit normalem serumfreiem DMEM-Medium, das 100 nM MitoTracker enthielt, behandelt. Unmittelbar danach wurden die Medien durch normale Wachstumsmedien ersetzt und unter einem Zeiss Compound Light-Mikroskop abgebildet. Die Bilder wurden mit der gleichen Belichtungszeit für die Proben desselben Experiments aufgenommen. Die Intensität der Fluoreszenz ist direkt proportional zum Membranpotential.

25 µl 100 % Matrigel (Fisher, Katalog-Nr. 354234) wurden auf jede Vertiefung eines 8-Kammer-Objektträgers mit vorgekühlten 200 µl sterilen Pipettenspitzen verteilt. Anschließend wurde die Platte 30 Minuten lang in einen Inkubator bei 37 °C gelegt, damit das Matrigel aushärtete. In der Zwischenzeit wurden die Zellen trypsinisiert, einmal mit PBS gewaschen, durch ein 40-µm-Zellsieb filtriert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, und gezählt. Die Zellen wurden auf dem Matrigel-beschichteten Objektträger mit einer Aussaatdichte von 5000 Zellen/Vertiefung in einem 300-µl-Volumen Wachstumsmedium mit 2 % Matrigel ausgesät. Für jede Zelllinie oder Behandlungsbedingung wurden die Zellen dreifach ausgesät und 7 Tage lang bei 37 °C inkubiert, um das Wachstum von 3D-Zysten in Suspension zu ermöglichen. Während dieser Zeit wurden die Vertiefungen 72 Stunden nach dem ersten Einbringen in Matrigel mit Wachstumsmedium ergänzt. Am siebten Tag wurden die Kammerobjektträger auf einem Leica DMI 3000B-Lichtmikroskop abgebildet. Die Bilder wurden mit der ImageJ-Software analysiert, um Messungen der Zystengröße zu erhalten. Jeder Test wurde mindestens dreimal wiederholt. Die Messungen aus jedem Experiment wurden kombiniert und auf statistische Signifikanz analysiert.

Weibliche Mäuse mit potenziellem Pkd1+/+; Pkd1∆17/+- und Pkd1∆17/∆17-Embryonen wurden am Embryonaltag (E) 13,5 in PBS präpariert, um die Nieren und den Schwanz zu ernten. Der Schwanz jedes Embryos wurde zur DNA-Extraktion und anschließenden Genotypisierung verwendet. Die Nieren wurden wie beschrieben für die Kultur auf Whatman-Membranen (Sigma, Katalognummer WHA110409) in einer Luft-Medium-Grenzfläche vorbereitet28. Die Nieren wurden in basalem DMEM (Thermo Fisher, Katalog-Nr. 12500) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS), 2 % PenStrep (Invitrogen, Katalog-Nr. 1514022), 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin, 2,8 nM enthielt Natriumselenit, 25 ng/ml Prostaglandin E und 32 pg/ml T3. Eine Niere wurde in den oben genannten Medien gezüchtet, und die kontralaterale Niere wurde in mit 100 µM 8-Br-cAMP (Sigma, Katalog-Nr. B7880) ergänzten Medien gezüchtet. Unter Verwendung einer zweiten Kohorte von Mäusen wurde eine Niere in 100 µM 8-Br-c-AMP oder 100 µM 8-Br-c-AMP + 250 µM SAM gezüchtet. Bei allen Kulturen wurde das Medium alle 48 Stunden gewechselt. Die Kulturen wurden am 4. Tag live mit dem Zeiss Stereo Lumar-Mikroskop abgebildet. Die Zysten wurden mit der ImageJ-Software gemessen und analysiert. Nach Ablauf von 6 Tagen wurden die Nieren schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung zur RNA- oder Proteinextraktion bei –80 °C gelagert.

Pkd1RC/- und Pkd1RC∆17/- Zellen (3 × 10^3 Dichte) wurden auf 96-Well-Platten ausgesät. Am nächsten Morgen wurde das Medium so geändert, dass es 1X AlamarBlue-Reagenz (Invitrogen, Katalognummer DAL1025) und Vehikel, 100 µM 8-Br-cAMP, 100 µM SAM oder 17 mM Glucose enthielt. Kolorimetrische Messungen wurden nach 12 Stunden bei 570 nm und 600 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät durchgeführt. Die Redoxreaktion von alamarBlue wurde verwendet, um die Zellproliferation quantitativ zu bewerten. Für jede Bedingung wurde N = 8 verwendet. Die Werte wurden mit dem Python MatplotLib-Paket als skalierte Heatmap dargestellt. Der gleiche experimentelle Ansatz wurde für Pkd1RC∆/- verwendet; Pkd2∆17/∆17-Zellen und die Kontrollzellen Pkd1RC/-; Pkd2+/+.

Das Serumkreatinin wurde durch Kapillarelektrophorese vom UT Southwestern O'Brien Center gemessen. BUN wurde mit dem Vitros250-Analysator des UT Southwestern Metabolic Phenotyping Core gemessen.

Die Gesamt-RNA wurde mit miRNeasy Mini-Kits (Qiagen) aus Nieren extrahiert. Die kleine RNA-Fraktion (<300 Nukleotide) wurde auf einem μParaflo Microfluidic-Chip hybridisiert, der Nachweissonden für alle Maus-microRNAs (miRNAs) in der miRBase-Version 17 (miRBase, http://microrna.sanger.ac.uk/sequences) enthielt. Die hybridisierten Microarray-Chips wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und mit einem Laser gescannt, um Fluoreszenzbilder zu erhalten. Die Signalwerte für jede Probe wurden durch Hintergrundsubtraktion und Normalisierung abgeleitet. Microarray-Chip-Hybridisierung, Fluoreszenzmarkierung, Laserscanning sowie Hintergrundsubtraktion und -normalisierung wurden von LC Sciences durchgeführt. Die Signalwerte aus jeder der fünf Altersgruppen (P2, P7, P14, P35) wurden gemittelt und die P-Werte mithilfe der einfaktoriellen ANOVA berechnet. Die differenziell erfassten Signale sind durch P < 0,05 definiert.

Die Qualitätskontrolle der Sequenzierung wurde mit FastQC v0.11.8 durchgeführt. RNA-seq-Lesevorgänge wurden gekürzt und Lesevorgänge mit geringer Qualität wurden mit Trimgalore v0.6.3_dev (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) mit dem Parameter „paired“ und einer Länge von 150 entfernt bps. Zugeschnittene Fastq-Sequenzen wurden mit dem STAR-Aligner v2.5.3a an das Maus-Referenzgenom GRCm38 angepasst, wobei die erzeugten BAM-Dateien mithilfe der Option „--outSAMtype BAM SortedByCoordinate“ nach Koordinaten sortiert wurden. 56,57“ Rohe Lesegenzahlen wurden mit dem STAR-Aligner mit den Optionen „—quantMode GeneCounts“ und „--sjdbGTFfile“ mit Genmodellen im GTF-Format erhalten, die aus der Maus-EnsEMBL-Version 94 stammen. Die Alignment-Qualitätskontrolle und Lesekartierungsstatistiken wurden von erhalten Picard-Tools v2.20.3 mit der Funktion „CollectMultipleMetrics“ (http://broadinstitute.github.io/picard/).

Rohe Genzahlen wurden zur Qualitätskontrolle und zur Analyse der differentiellen Expression verwendet. Die Rohzahlen wurden durch Berechnung von log2CPM (Anzahl pro Million) auf die Gesamtzahl der Lesevorgänge normalisiert. Wir haben die log2CPM-Verteilung und ihre Beziehung zur Standardabweichung sorgfältig untersucht und den geeigneten Cutoff (durchschnittlicher Log2CPM < –3) ermittelt, um niedrig exprimierte Gene vor der Analyse der differentiellen Genexpression zu eliminieren. Die TPM-Quantifizierung (Transkript pro Million) wurde mit RSEM v1.3.1 durchgeführt, und die Analyse der differentiellen Genexpression wurde mit dem Limma-Trend (Version 3.40.6) in R58,59 durchgeführt.

Die Quantifizierung einzelner Pkd1-Transkripte wurde mit Salmon v1.3.060 durchgeführt. Die fünf verschiedenen Transkriptversionen für Pkd1 wurden dem RefSeq mm9-Fasta-Referenztranskriptom hinzugefügt, um einen neuartigen Lachsindex zu erstellen. Anschließend wurden die Fastq-Dateien direkt zugeordnet und die Lesezählungen durchgeführt, und die TPM-Werte wurden mit dem Standardprozess quantifiziert.

Pkd1RC/--Zellen wurden bei 2 × 10^5 Konfluenz in 6-Well-Platten ausgesät. Am nächsten Morgen wurden die Zellen mit Lipofectamine 3000 mit einem Vehikel, Kontrolloligonukleotid oder RGLS4326 in einer Endkonzentration von 100 µM transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen zur RNA-Extraktion gesammelt. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen zur Proteingewinnung geerntet oder weiter für den AlamarBlue-Assay und den 3D-Zystogenese-Assay ausgesät. Für das in Abb. 5C gezeigte Experiment wurde der 3D-Zystogenese-Assay mit unbehandelten Pkd1RC/--Zellen durchgeführt, wie im Abschnitt „Methoden“ des 3D-Zystogenese-Assays beschrieben, mit den folgenden Änderungen. Am vierten Tag der Matrigel-Kultur wurden die Vertiefungen mit dem Leica-Lichtmikroskop DMI 3000B abgebildet, und dann wurden die Kulturen mit einem Vehikel, 100 µM Kontrolloligonukleotid oder 100 µM RGLS4326 transfiziert und drei weitere Tage lang gezüchtet. Am 7. Tag wurden die Proben einer Bildgebung unterzogen, um die Zystengröße zu bestimmen.

Das KspCre; Für die Arzneimittelstudien wurde die Pkd1F/RC-Mauslinie verwendet. Den Mäusen wurden nach dem Zufallsprinzip 20 mg kg-1 Vehikel (PBS), Kontrolloligonukleotid oder RGLS4326 über subkutane Injektionen verabreicht. Für die erste Zystenpräventionsstudie (Abb. 5D–G) wurden Mäuse an den postnatalen Tagen (P) 10, P11, P12 und P16 injiziert und am P18 getötet. An denselben Tagen wurden auch nicht-transgene, stammangepasste Mäuse getötet. Für die zweite Krankheitsstabilisierungsstudie (Abb. 5H – K) wurden Mäuse bei P16 und P17 injiziert und bei P26 getötet. Eine Maus aus der Studie erlag der Krankheit und starb im Alter von weniger als 26 Tagen. Für die dritte Langzeitstudie (Abb. 5L–N) wurden Mäusen P16 und P17 und dann jede Woche bis zum Alter von 18 Wochen eine Injektion verabreicht. Eine andere Kohorte von Mäusen erhielt die gleiche Dosis der RGLS4326-Behandlung auf P16 und P17 und danach halbmonatlich bis zum Alter von 18 Wochen. Die Mäuse wurden 18 Wochen lang jeden Tag beobachtet, um den Tod festzustellen. Am Ende der 18 Wochen wurden die überlebenden Mäuse zur Gewebeentnahme geopfert. In allen Studiengruppen wurden gleich viele Männer und Frauen verwendet.

Primäre humane ADPKD-Zystenzellen wurden von PKD Research Biomarker and Biomaterial Core am University of Kansas Medical Center (KUMC) erhalten. Die Verwendung von chirurgisch entsorgtem Nierengewebe entsprach den Bundesvorschriften und wurde vom Institutional Review Board am University of Kansas Medical Center genehmigt. Die PKD1- und PKD2-Mutationsanalyse der DNA aus Spenderzystenzellen wurde von Ambry Genetics (Aliso Viejo, CA) durchgeführt. Jede primäre Zelllinie wurde in DMEM/F12 + + (Gibco, Katalog-Nr. 10565–018) kultiviert, ergänzt mit 10 % FBS, 5 μg kg-1 Insulin, 5 μg mL-1 Transferrin und 5 ng mL-1 Natriumselenit in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 °C bis zu einer Konfluenz von 80 % inkubiert. Bei der zweiten Passage wurden die Zellen jedes menschlichen Spenders einer umgekehrten Transfektion mit CRISPRMAX-Reagenz (Invitrogen) unterzogen, das Cas9-Protein (IDT) und synthetische sgRNAs (IDT) enthielt, oder sie wurden mit Vehikel (ohne Cas9) transfiziert. Die Cas9/sgRNA-transfizierten Kulturen sind eine gemischte Population aus editierten und nicht editierten Zellen. Eine klonale Vermehrung war nicht möglich, da es sich um Primärzellen handelt, die nur eine begrenzte Anzahl von Passagen zulassen. Cas9- oder Vehikel-transfizierte Zellen (Kontrolle) wurden dann in 6-Well-Platten und Kammerobjektträger ausgesät. Nach 72 Stunden wurden die Zellen zur Genotypisierung, Western-Blot-Analyse und Immunfluoreszenz/MitoTracker-Färbung geerntet. Darüber hinaus wurden die Zellen 72 Stunden nach der Transfektion trypsinisiert und mit einer Dichte von 4000 Zellen/Well in 200 μl Medium plus Matrigel (Corning, Katalog-Nr. 354234) in einer 96-Well-Platte (Corning, Katalog-Nr. 353072) ausplattiert. Die Medien wurden 72 Stunden nach der ersten Platzierung in Matrigel wieder aufgefüllt. Zystenbilder wurden am 7. Tag der Matrigel-Kultur (10. Tag nach Cas9/SgRNA- oder Vehikeltransfektion) aufgenommen. Von jedem Spender wurden einhundert Zystenbilder für Cas9- oder Vehikel-transfizierte Zellen erhalten. In ähnlicher Weise wurden 72 Stunden nach der Transfektion Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen/Well in 96-Well-Platten für den AlamarBlue-Proliferationstest ausgesät. Am folgenden Tag wurde das Medium durch Wachstumsmedium mit 1X AlamarBlue ersetzt und die Messungen 12 Stunden später durchgeführt.

Alle Experimente wurden mit mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt und zeigten eine erfolgreiche Reproduzierbarkeit. Bei In-vivo-Experimenten ist N die Anzahl der analysierten Mäuse. Bei In-vitro-Experimenten bezieht sich N auf die Anzahl der biologischen Replikate. Für paarweise Vergleiche und Varianzanalysen (ANOVA) wurde der zweiseitige Student-T-Test verwendet, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Zur Analyse des Mausüberlebens wurde der Mantel-Cox-Test verwendet. Alle Daten wurden mit der Prism-Software (GraphPad-Software) analysiert. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Stichprobengröße und die P-Werte werden in den Abbildungsdiagrammen, den Abbildungslegenden oder im Ergebnisabschnitt erwähnt. Für die RGLS4326-Studien wurden die Tiere zufällig den Behandlungsarmen zugeordnet. Die Forscher waren hinsichtlich der Behandlung oder der Genotypen der Tiere nicht blind.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die RNA-seq-Datensätze wurden im NCBI Gene Expression Omnibus-Repository unter der Zugangsnummer GSE196237 hinterlegt. Der Microarray-Datensatz wurde im NCBI Gene Expression Omnibus-Repository unter der Zugangsnummer GSE208429 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01DK102572) und des Verteidigungsministeriums (D01 W81XWH1810673) unterstützt. VP RL wird vom National Institute of Health (K08DK117049) sowie Zuschüssen der PKD Foundation und der American Society of Nephrology unterstützt KidneyCure-Stipendienprogramm. Wir danken dem O'Brien Kidney Research Core Center (P30DK079328) am UT Southwestern Medical Center, dem Eugene McDermott Center for Human Growth and Development Sequencing Core and Bioinformatics Lab an der UT Southwestern, dem UT Southwestern Molecular Pathology Core und der UT Southwestern Whole Brain Microscopy Facility, Genewiz und Monoceros für die Bereitstellung wichtiger Reagenzien und Dienstleistungen. Menschliche ADPKD- und normale menschliche Nierenzellen und -gewebe wurden vom PKD Biomarkers and Biomaterials Models Core am University of Kansas Medical Center bereitgestellt. Der Core ist Teil des PKD Research Resource Consortium, unterstützt von den National Institutes of Health/NIDDK (U54 DK126126).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ronak Lakhia, Harini Ramalingam.

Abteilung für Innere Medizin, Nephrologie, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Ronak Lakhia, Harini Ramalingam, Chun-Mien Chang, Patricia Cobo-Stark, Laurence Biggers, Andrea Flaten, Jesus Alvarez und Vishal Patel

Regulus Therapeutics Inc., San Diego, CA, 92121, USA

Tania Valencia und Edmund C. Lee

Abteilung für Innere Medizin und Jared Grantham Kidney Institute, University of Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas, USA

Darren P. Wallace

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RL, HR, CC und VP entwarfen, führten Experimente durch und/oder analysierten Daten mit miR-17-Motivdeletionen. AF, TV, EL, CM, HR, RL und VP haben Experimente entworfen, durchgeführt und/oder Daten im Zusammenhang mit RGLS4326-Studien analysiert. DW stellte menschliche ADPKD-Zellen zur Verfügung. PC, JA, HR, RL und VP entwarfen, führten Experimente durch und/oder analysierten Daten mit menschlichen ADPKD-Zellen. HR, RL und VP haben die Zahlen vorbereitet; VP hat das Manuskript mit Beiträgen von HR und RL verfasst

Korrespondenz mit Vishal Patel.

VP besitzt Patente mit Anti-miR-17 zur Behandlung von ADPKD (16/466.752 und 15/753.865). VP ist als wissenschaftlicher Berater für Otsuka Pharmaceuticals, Maze Therapeutics und Regulus Therapeutics tätig. VP Lab hat eine geförderte Forschungsvereinbarung mit Regulus Therapeutics. VP Lab verfügt außerdem über eine gesponserte Forschungsvereinbarung mit Sanofi SA, Myonid Therapeutics und Vifor Pharmaceuticals, die nichts mit dieser Arbeit zu tun haben. TV und E L. sind Mitarbeiter von Regulus Therapeutics. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lakhia, R., Ramalingam, H., Chang, CM. et al. Die PKD1- und PKD2-mRNA-cis-Hemmung treibt das Fortschreiten der polyzystischen Nierenerkrankung voran. Nat Commun 13, 4765 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32543-2

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Eingegangen: 27. Januar 2022

Angenommen: 04. August 2022

Veröffentlicht: 15. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32543-2

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