Über die Spore hinaus beeinflusst der Exosporiumzucker Anthrose die vegetative Genregulation von Bacillus anthracis in cis und trans

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 5060 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Bacillus anthracis-Exosporium-Napf ist der äußerste Teil der Sporen, der mit der Umwelt und den Wirtssystemen interagiert. Veränderungen dieser Schicht haben das Potenzial, weitreichende physiologische und immunologische Prozesse zu beeinflussen. Der einzigartige Zucker, Anthrose, umhüllt normalerweise die Exosporiumschicht an ihren distalsten Stellen. Wir haben zuvor zusätzliche Mechanismen identifiziert, die B. anthracis anthrose negativ machen. In dieser Arbeit werden mehrere neue Ameisenstämme von B. anthracis identifiziert und der Einfluss der Anthrose-Negativität auf die Sporenphysiologie untersucht. Wir zeigen, dass abgeschwächte Sterne-Lebendimpfstoffe sowie Milzbrandimpfstoffe mit Kulturfiltrat Antikörper erzeugen, die auf Nicht-Proteinkomponenten der Sporen abzielen. Die Rolle von Anthrose als vegetatives Signalmolekül von B. anthracis Sterne wird durch Assays mit lumineszierenden Expressionsstämmen, RNA-seq-Experimente und die Analyse der Toxinsekretion mittels Western Blot impliziert. Reine Anthrose und das sporulationsinduzierende Nukleosidanalogon Decoyinin hatten ähnliche Auswirkungen auf die Toxinexpression. Co-Kultur-Experimente zeigten, dass Genexpressionsänderungen in B. anthracis zusätzlich zum Anthrose-Status extrazellulärer Interaktionen (trans) vom intrazellulären Anthrose-Status (cis) abhängen. Diese Ergebnisse liefern einen Mechanismus dafür, wie ein einzigartiger sporenspezifischer Zuckerrest die Physiologie, Expression und Genetik des vegetativen B. anthracis beeinflusst und Auswirkungen auf die Ökologie, Pathogenese und Vakzinologie von Anthrax hat.

Das Bakterium Bacillus anthracis verursacht Milzbrand und kann raue Umweltbedingungen durch Sporenbildung überleben1. Die Endosporen sind von einer losen Proteinschicht umgeben, die reich an Kohlenhydraten ist und als Exosporium2 bezeichnet wird. Während der Sporulation wird das Exosporium um die Vorspore herum angeordnet, während es sich in der Mutterzelle durch eine koordinierte Anstrengung der Proteine ​​CotE, CotO und CotY bildet3. Der nach außen gerichtete Teil des Exosporiums besteht aus Glykoproteinen, die eine klettartige Schicht bilden, die als Exosporium-Nap bekannt ist. Der Flor enthält hervorstehende Stiele der glykosylierten BclA- und BclB-Proteine, die an die Basalschichtproteine ​​ExsFA/BxpB und ExsFB4,5 gebunden sind. Das Glykoprotein-Exosporium-Nap verleiht der Spore eine geladene Oberfläche und ist die distale Oberfläche, die Wechselwirkungen zwischen ruhenden Sporen und der äußeren Umgebung, einschließlich Bodenpartikeln, tierischen Wirtszellen und anderen Sporen, vermittelt. Bei der Keimung wird der Exosporium-Schlaf abgestoßen und B. anthracis beginnt zu keimen, repliziert sich dann in vegetativer Form und sondert dabei Anthrax-Toxin ab6.

Acht Proteine ​​wurden als wesentliche Bestandteile des Exosporiums identifiziert, wenn sie aus Exosporien hergestellt wurden, die gewaschen wurden, um jegliche vegetative Zellproteine ​​zu entfernen7. Das BclA-Protein ist der Hauptproteinbestandteil des Exosporiums und bildet die stielartigen Noppenfasern, die aus der Oberfläche des Exosporiums herausragen. Die Länge der kollagenähnlichen Wiederholungsregionen von BclA variiert je nach BclA-Gengröße zwischen den Stämmen von B. anthracis. Diese Polymorphismen tragen zu beobachtbaren Veränderungen der Flordicke auf der Sporenoberfläche bei8. BclA ist in trimeren Formationen vorhanden, in denen kollagenähnliche Regionen dicht mit Pentasaccharid-Wiederholungen von GalNAc-Rha-Rha-Rha-Ant9 glykosyliert sind. Ant ist das Monosaccharid Anthrose und ein seltener Zucker, der nur an wenigen Orten in der Natur vorkommt. Das Anthrose-Biosyntheseoperon ist gut charakterisiert und besteht aus den vier Genen antA, antB, antC und antD10,11. Alle Gene sind an der Anthrose-Biosynthese beteiligt, wobei das Ausschalten von antA die messbare Sporen-Anthrose um die Hälfte reduziert und das Ausschalten von antB, antC oder antD die nachweisbaren Sporen-Anthrose-Spiegel aufhebt11. Anthrose wird von anderen Bacillus spp. nicht synthetisiert. und ist daher einzigartig auf der Oberfläche von B. anthracis-Sporen vorhanden. Alternative Zuckerrückstände finden sich auf Sporen anderer Bacillus spp., wie z. B. Cereose auf Bacillus cereus-Sporen12,13. Obwohl sich BclA auf der Oberfläche des Exosporiums befindet, ist sein Beitrag zur Pathogenese unklar. BclA war für die volle Virulenz in hochdosierten Sterne4- oder Ames14-Maus-Challenge-Experimenten nicht erforderlich, während in einer anderen Studie ein ΔbclA Sterne 34F2-Mutant eine 50–70 %ige Reduzierung der LD50 im Vergleich zum Wildtyp Sterne 34F215 aufwies. Das Studiendesign mit hoher Dosis kann die Virulenzeffekte des bclA-Knockouts mit fulminanter Toxin- und Kapselproduktion verschleiern, die in empfindlicheren LD50-Studien aufgedeckt werden können. Wichtig ist, dass ein BclA-Knockout Anthrose effektiv von der Sporenoberfläche entfernt, während seine Biosynthese in vegetativen Zellen intakt bleibt. Es hat sich gezeigt, dass das Ausschalten von BclA die Assoziation mit Epithelzellen, Fibroblasten und Endothelzellen erhöht, jedoch nicht mit Makrophagen16. Dies wurde von anderen bestätigt, die zeigten, dass BclA-Knockout-Sporen nicht in der Lage waren, an den Makrophagenrezeptor CD14 zu binden, während die Entfernung von Anthrose aus BclA in antC/degT-Knockout-Sporen die Bindung an den CD14-Rezeptor erhöhte, indem sie die Rhamnose-Reste freilegten17. Dies stimmt mit den Erkenntnissen überein, dass Mäuse, die mit bclA-Mutantensporen provoziert wurden, nach der Aerosolprovokation mehr Sporen in der bronchoalveolären Lungenflüssigkeit behalten14. Die genaue Funktion von Anthrose und sein Beitrag zur Pathogenese blieben unklar, es gab Hinweise auf eine Interaktion mit der Bodenumgebung und Zellen des Immunsystems. Zuvor haben wir festgestellt, dass die Entfernung von Anthrose von der Sporenoberfläche die Keimungseffizienz verringert und die Sporulationsraten in einem heterologen Sterne-Modell von B. anthracis erhöht18. Neben physiologischen Veränderungen hatten Anthrose-negative Sporen in einem subkutanen Maus-Challenge-Modell die Hälfte der LD50, was zu einer schnelleren Todeszeit und einer schnelleren Verbreitung in den Wirtsorganen führte. Eine Erhöhung der Letalität wurde auch in einem zweiten Tiermodell beobachtet, indem Galleria mellonella-Larven mit Sporen in Kontakt gebracht wurden18.

Bisher ging man davon aus, dass der Mangel an Anthrose auf eine Untergruppe einzigartiger B. anthracis beschränkt ist, die im Tschad, Mali, Kamerun19 und Nigeria isoliert wurde und treffend als Westafrika-Gruppe (WAG)20 bezeichnet wurde. Diese Stämme haben ein konserviertes SNP- und Nukleotid-Triplikationsereignis, das sie zu Ant- macht. Wir haben zuvor zwei Stämme von B. anthracis genetisch identifiziert – über chromosomale Deletionen, die das gesamte biosynthetische Operon von Anthrose umfassen, einen aus Chile und einen aus Polen, in unserer globalen B. anthracis-Sammlung18,21. Eine Suche in öffentlich zugänglichen Sequenzaufzeichnungen ergab, dass der B. anthracis-Stamm Ba4599 Heroin, der aus einem europäischen Milzbrandfall im Zusammenhang mit mit B. anthracis-Sporen kontaminiertem Heroin isoliert wurde, einen neuartigen SNP aufwies, der mit dem Ameisengenotyp verknüpft war. Diese drei Beobachtungen erweiterten die Mechanismen und die geografische Verteilung von Anthrose-negativen Stämmen über die ursprünglichen WAG-Beobachtungen hinaus und machten das Verständnis ihrer geografischen Herkunft und der Auswirkungen des Sporen-Anthrose-Verlusts umso dringlicher.

Hier analysieren wir die Anthrose-Negativität ausgehend von einer epidemiologischen Perspektive, während wir die Breite der sich häufenden Anthrose-Mutationen verstehen. Durch die Untersuchung kürzlich hinterlegter Sequenzierungsdateien der nächsten Generation erweitern wir unser Wissen über die geografische Verteilung von Anthrose-negativen Stämmen und bringen sie mit Ausbrüchen von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit in Verbindung. Dies liefert den Kontext für die Analyse der Rolle, die Anthrose in der Zelle spielen könnte, und wie B. anthracis durch seine Abwesenheit beeinflusst wird. Das Verständnis der Folgen des Anthrose-Verlusts für die physikalischen Eigenschaften der Spore würde Aufschluss darüber geben, ob Anthrose dem Exosporium-Schlaf angeborene Eigenschaften verleiht. Neben den physikalischen Eigenschaften der Sporenoberfläche reagieren viele Bakterien auf biosynthetische Metaboliten wie Laktose oder Arabinose und verändern die Genexpression entsprechend. Viele frühere Studien entfernten BclA durch Genmutation von der Oberfläche der Sporen, dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die Produktion von Anthrose in der Zelle im Hinblick auf die Sporulation. Um die Rolle von Anthrose in der Zellphysiologie von Bakterien zu untersuchen, haben wir uns in dieser Arbeit auf den Vergleich von Wildtyp- und Anthrose-Mutanten konzentriert. Wir wollten globale Genexpressionsverschiebungen als Reaktion auf das einzigartige sporenverzierende Monosaccharid Anthrose charakterisieren. Anthrose könnte während des vegetativen Wachstums Verschiebungen im Transkriptom von B. anthracis verursachen, indem es als genetischer Induktor/oder Repressor im Rahmen des Stoffwechselflusses auf dem Weg zur Sporulation fungiert. Dies würde als aktiver selektiver Druck für die Mutation des Anthrose-Operons während des vegetativen Wachstums dienen. Insbesondere können wichtige Virulenzmechanismen im Zusammenhang mit vegetativem Wachstum, wie z. B. die Toxinsekretion, durch den Anthrosefluss beeinflusst werden. RNA-seq in Verbindung mit Experimenten mit lumineszierenden Reporterstämmen wurde verwendet, um die Genexpression in Gegenwart von Anthrose zu untersuchen. Ein genauerer Blick auf die veränderten immunologischen Eigenschaften der Spore liefert weitere Hinweise darauf, dass die Modifikation des Sporenoberflächenepitops die damit verbundenen Immunreaktionen umgehen kann. Wir haben mehrere lumineszierende Reporterstämme im Hintergrund von B. anthracis Sterne hergestellt, um die Auswirkung des Anthrose-Status auf die Geninduktion im Zeitverlauf zu charakterisieren. Die Behandlung von B. anthracis-Lumineszenzreportern mit gereinigter Anthrose und Decoyinin (ein von Streptomyces produzierter Bacillus-Sporulation induzierender GMP-Synthatase-Inhibitor) ergab regulatorische Unterschiede bei Anthrose-positiven und -negativen Stämmen. Schließlich wurde die Co-Kultur von Lumineszenzreportern mit Anthrose-positiven und -negativen Stämmen verwendet, um zu untersuchen, ob native Anthrose-Spiegel die Genexpression in benachbarten Zellen veränderten. Insgesamt stellt diese Arbeit die Anthrose-Negativität als eine phänotypische Mutation dar, die sich auf die Physiologie des vegetativen B. anthracis auswirken und gleichzeitig die Struktur der Sporen verändern kann.

Ein Rückblick auf unsere bisherigen Arbeiten und eine eingehende Analyse zeigen mehrere genetische Mechanismen für den Anthroseverlust. In Verbindung mit diesen vielfältigen Mechanismen ist die geografische Verbreitung von Ameisenstämmen weit (über mindestens 15 Länder) und über einen langen Zeitraum (mehr als 70 Jahre) verbreitet. Die Analyse der bekannten Ameisenstämme im Verhältnis zu mehreren Typstämmen und anderen interessierenden B. anthracis-Stämmen mittels SNP-Vergleich des gesamten Genoms zeigt ihre Verwandtschaft mit anderen B. anthracis-Typstämmen und untereinander (Abb. 1). Die Etikettenfarben repräsentieren verschiedene B. anthracis-Abstammungslinien und Abstammungslinien, die für diese Arbeit wichtig sind. Die Fremdgruppe Bacillus cereus gruppierte sich am nächsten zum repräsentativen Stamm A1055 der C-Gruppe. Eine Zusammenfassung der genetischen Signaturen, Stämme und relevanten epidemiologischen Daten von Ameisen finden Sie in Tabelle 1.

Gesamtgenom-SNP-Baum bekannter Ameisenstämme von Bacillus anthracis im Verhältnis zu anderen B. anthracis-Linien. Auf der rechten Seite der Abbildung sind verschiedene B. anthracis-Gruppen und Abstammungslinien beschriftet, die für diese Arbeit von Interesse sind. Die orangefarbenen Punkte zeigen Stämme in unserer Sammlung an, die Anthrose-negativ sind. Die verschiedenfarbigen Etiketten sollen dabei helfen, die Abstammungslinien zu unterscheiden. Die rot hervorgehobenen Zweigmarkierungen weisen auf B. anthracis-Stämme hin, die bei der Abfrage der gesamten Genomsequenz Anthrose-negativ sind. B. cereus ist von Natur aus Anthrose-negativ, nicht aufgrund diskreter Mutationen, und daher wird der Zweig nicht rot hervorgehoben. Die Zweiglängen werden über den Zweigen angezeigt, darunter befinden sich Bootstrap-Werte von 100. Der Baum wurde in der Außengruppe von B. cereus verwurzelt. Verschiedene Stämme über alle Abstammungslinien hinweg erwerben auf unterschiedliche und unabhängige Weise Anthrose-Negativität. Der gesamte phylogenetische SNP-Genombaum in dieser Abbildung wurde durch Analyse mit PhaME54 erstellt und mit iTOL55 visualisiert.

Um die physikalische Veränderung des Exosporium-Schlafs zu beobachten, die in Abwesenheit von Anthrose auftritt, wurde eine Transmissionselektronenmikroskopie der Sporen durchgeführt. Aus B. anthracis Sterne WT, B. anthracis Sterne ΔantC und B. anthracis Sterne ΔantC/COMP hergestellte Sporen wurden fixiert und einem Hochdruckgefrieren unterzogen und dann bei 15.000-facher Vergrößerung beobachtet (Abb. S1A–F). Der Exosporium-Nap von zehn Sporenbildern aus zwei verschiedenen Präparaten wurde digital geschält, um eine topografische 3D-Wärmekarte zu linearisieren und zu visualisieren (Abb. 2A–C). Qualitativ zeigen die Bilder, dass der Flor des WT-Stammes im Vergleich zum Anthrose-negativen ΔantC-Mutanten elektronendichter (violett) ist (Abb. 2C). Die Anthrose-Komplementsporen weisen sehr dichte Florbereiche auf, deren Dichte im Allgemeinen über die gesamte Spore unregelmäßiger war. Aus den linearisierten Nickerchenbildern wurden Histogramme als Maß für die Pixelfläche erstellt und zum quantitativen Vergleich der Exosporiumfaserdichte zwischen Stämmen verwendet (Abb. 2D). Die Daten zeigten, dass die Dichte der Exosporium-Noppenfasern in der ΔantC-Mutante am niedrigsten war, während WT und ΔantC/COMP ähnliche Dichten aufwiesen.

Analyse des Exosporiums durch fasertopografisches Oberflächendiagramm und Western Blot. (A) Ein Beispiel für ein einzelnes Sporenbild, das mit Fidschi analysiert wurde, um die Exosporium-Florschicht von der Sporenoberfläche zu „schälen“. (B) Zehn zufällig ausgewählte B. anthracis Sterne WT-, ΔantC-, ΔantC/COMP-Sporen hatten ihr Exosporium-Nap angeordnet. (C) Die Florschichten dieser zehn Sporen wurden in ein topografisches 3D-Oberflächendiagramm umgewandelt, um die Visualisierung der mit den TEM-Bildern verbundenen Elektronendichte zu erleichtern. (D) Die Schwarz-Weiß-Bilder in (B) wurden in Histogramme umgewandelt und ihre Flächen bestimmt. *p < 0,05; ns = nicht signifikant. Einzelwerte, Durchschnittswerte und 95 %-KI werden angezeigt. (E) Polyklonaler Ab gegen rBclA wurde verwendet, um 1 × 107 gereinigte Sporen jedes Stamms zu blotten. Der rote Pfeil zeigt eine leichte Abnahme des Molekulargewichts an, die mit der Deletion von Anthrose verbunden ist. (F) Die gleichen Sporenpräparate in (E) wurden gegen gepooltes menschliches AVA-Serum geblottet, was auf eine Immunreaktivität gegenüber dem Sporenantigen hinweist. Regionen mit hohem Molekulargewicht, die mit der BclA-Reaktivität in (E) zusammenfallen, werden durch die gestrichelte Klammer angezeigt.

Western Blots wurden an einer gleichen Anzahl von Sporen des WT-, ΔantC- oder ΔantC/COMP-Stamms durchgeführt, um festzustellen, ob der Anthroseverlust die scheinbare BclA-Größe und die Reaktivität mit Immunserum beeinflusst. Durch die Entfernung von Anthrose könnten BclA-Epitope freigelegt werden, die ansonsten durch hydrophobe Zuckereinheiten maskiert würden, was Auswirkungen auf das mit Anthrax-Impfstoffen verbundene Immunrepertoire hätte. Polyklonale Antikörper gegen rekombinantes BclA-Protein, das mit dem Anthrose-bestückten Pentasaccharid verzierte Protein, wurden zum Nachweis der BclA-Proteingröße verwendet (Abb. 2E). BclA ist ein etwa 21 kDa großes Protein, das aufgrund seiner zahlreichen Polysaccharidmodifikationen mit > 150 kDa auf einem SDS-PAGE-Gel laufen kann. Beim Blotting von Sporen ohne Anthrose (ΔantC) ist eine Verschiebung nach unten erkennbar. Das Blotting der gleichen Sporenpräparate mit gepooltem, mit Milzbrandimpfstoff adsorbiertem (AVA) geimpftem Humanserum zeigt, dass das Humanserum im Vergleich zu WT im hochmolekularen Bereich der BclA-Region eine mäßig geringere Bindung an ΔantC-Sporen aufweist, während es im niedermolekularen Bereich eine erhöhte Bindung aufweist Gewicht BclA- und PA-Region (Abb. 2F). Um die Reaktivität des Impfserums gegenüber Nicht-Protein-Bakterienkomponenten in vegetativen Bakterien und Sporen weiter zu untersuchen, wurde das Protein mit Proteinase-K abgebaut und anschließend mit Kaninchen-Anti-B geblottet. polyklonaler Anthracis-Antikörper, gepooltes menschliches AVA-Plasma, Sterne-geimpftes Bisonserum und naives Bisonserum (Abb. S2A – E). Naives Bisonserum reagierte nicht auf alle auf dem Gel durchgeführten Proben (Abb. S2D). Die Immunserumproben reagierten stark mit unbehandelten vegetativen Zellen (Spuren 1), was mit einem Protein zusammenfiel, das bei ~ 83 kDa wanderte; das gleiche wie PA (Abb. S2B–D). Vegetative Zelllysate, die mit Proteinase-K behandelt wurden, um Proteine ​​abzubauen (Spur 2), zeigten eine geringe Reaktivität mit den Immunseren. Spur 3 jedes Blots sind Sporenlysate. Immunproben scheinen mit PA aus Sporenlysaten zu reagieren. PA kann an der Außenseite von Sporen binden22. Es sind sporenspezifische Banden mit hohem Molekulargewicht vorhanden. Wenn die Proteine ​​durch Proteinase-K-Behandlung abgebaut werden, reagiert ein hochmolekulares Material weiterhin mit jeder Immunprobe. Dieses Proteinase-K-resistente Material mit hohem Molekulargewicht fällt mit dem stark glykosylierten BclA-Protein zusammen, das für die Spore spezifisch ist. Beim Sterne-Impfstoff handelt es sich um einen Lebendimpfstoff mit abgeschwächten Sporen. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Bison-Serumprobe stark auf sporenspezifisches Nicht-Protein-Antigen reagierte (Abb. S2D). Der AVA-Impfstoff wird aus gefälltem Kulturfiltrat eines vegetativen, nicht eingekapselten B. anthracis-Sterne-Stamms hergestellt (ebenso wie der Anthrax-Impfstoff-präzipitierte (AVP)-Impfstoff); Ähnliche Stämme sind die abgeschwächten Lebendsporen, die im Veterinärimpfstoff verwendet werden23. Der für die AVA-Produktion verwendete B. anthracis-Stamm ist V770-NP1-R24. Dieser Stamm wird anaerob in einem Fermenter gezüchtet und das Kulturfiltrat wird an Alhydrogel adsorbiert. B. anthracis V770-NP1-R ist ein nicht-proteolytisches pXO2-negatives Derivat des Stammes V7701, der 1951 aus einem Fall von Rindermilzbrand in Florida isoliert wurde25. Die Blots zeigen eine Reaktivität gegenüber nicht-proteinsporenspezifischem Material, was auf eine geringe Menge hinweist sporenspezifisches Antigen ist in AVA vorhanden (Abb. S2E). Bei einer Analyse des ähnlich hergestellten AVP-Impfstoffs aus dem Vereinigten Königreich wurden zwar Sporen in Impfstoffproduktionsgefäßen festgestellt, die Forscher kamen jedoch aufgrund des Mangels an unterstützenden Daten zu dem Schluss, dass dies darauf zurückzuführen war, dass 30 % des Inokulums nicht keimten26. Proteomische Analysen des AVP-Impfstoffs ergaben, dass die Hauptbestandteile PA (64 %), LF (8 %) und EF (3 %) waren und 258 andere Proteine ​​die restlichen 25 % ausmachten; Nicht-Protein-Bestandteile wurden nicht analysiert27. BclA ist das immundominante Protein auf der Spore und seine Veränderung oder Modifikation, wie z. B. die Entfernung von Anthrose, könnte die Immunreaktivität in menschlichen und tierischen Wirten verändern.

Während des Wachstums der Mutante wurde eine verstärkte Verklumpung der Zellen in Schüttelbrühekulturen beobachtet. Die mikroskopische Analyse der Zellen im Laufe der Zeit zeigte, dass die Mutante längere Ketten vegetativer Zellen bildete, die bei der Sporulation der Bakterien biofilmartige Strukturen erzeugten (Abb. S3), was auf eine mögliche globale Rolle der Anthrose-Erkennung in der Physiologie von B. anthracis hinweist. Die Mutanten wurden im gesamten Genom sequenziert und es wurden keine Mutationen von Bedeutung festgestellt, die das beobachtete Verhalten unserer antC-Mutante erklären könnten.

Lumineszierende Expressionsmuster wichtiger B. anthracis-Promotoren werden durch den Anthrose-Status beeinflusst. Wachstums- und Lumineszenzexpressionsexperimente in HIB + Km10 wurden verwendet, um die Luxexpression der Promotoren (A) Pant, (B) PatxA, (C) Plef, (D) PpagA und (E) PsigF über 48 Stunden zu charakterisieren. In jedem Diagramm ist das Wachstum (OD bei 600 nm; erste Spalte des Diagramms) oder die Lumineszenz (RLU; zweite Spalte des Diagramms) des Sterne WT in Blau und der Sterne ΔantC-Mutanten in Rot dargestellt. Die Lumineszenzbildgebung fester Plattenkolonien nach 24 Stunden liegt unterhalb der Brühzeitverläufe. Wachstums- und Lumineszenzkurvendaten aus zwei unabhängigen Experimenten, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, wobei der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwerts zu jedem Zeitpunkt angezeigt werden.

Fünf lumineszierende Reporterplasmide wurden generiert, um eine Expressionsanalyse vom Anthrose-Operon-Promotor (Pant), dem atxA-Promotor (PatxA), dem letalen Faktor-Promotor (Plef), dem pagA-Promotor (PpagA) und dem sigF-Promotor (PsigF, auch bekannt als spoIIAA-) zu ermöglichen. spoIIAB-sigF-Promotor). Diese Plasmide wurden in B.anthracis Sterne und B.anthracis Sterne ΔantC konjugiert, von denen wir zuvor bestätigt hatten, dass sie keine Anthrose 18 produzieren konnten. Die resultierenden Stämme wurden dreifach in Heart Infusion Broth (HIB), einem Medium mit hohem Proteingehalt ohne Zucker, gezüchtet und getüpfelt auf festem HIB-Agar. Die RLU wurden 48 Stunden lang alle 10 Minuten in Brühe gemessen und nach 24 Stunden auf festen Medien abgebildet (Abb. 3A – E). Das Ausschalten der Anthrose-Produktion verschiebt die maximale Pant-Expression von 32 auf 26 Stunden, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Anthrose die Expression seines eigenen biosynthetischen Operons unterdrücken kann (Abb. 3A). Die Expression von PatxA ist in der Anthrose-Mutante stark reduziert (Abb. 3B). Während die Expression von Plef und PpagA in der Anthrose-Mutante im Vergleich zur WT anfänglich verzögert war, deuten große Spitzen nach 24 Stunden auf erhöhte Konzentrationen dieser Toxinkomponenten hin, wenn die Mutante in die stationäre Phase eintritt (rote Linien in Abb. 3C und D). Da Anthrose auf dem Exosporium der reifen Spore vorhanden ist, wurde der erste Vorsporen-spezifische Sigma-Faktor-Reporter sigF verwendet, um zu messen, ob das Ausschalten der Anthroseproduktion diesen speziellen Schritt beeinflusst. Die Expression von PsigF stieg in der Anthrose-Mutante langsamer an und näherte sich dann schließlich den Werten an, die im Sterne-WT beobachtet wurden (Abb. 3E).

Um die Beteiligung von Anthrose an der Toxinsekretion zu überprüfen, wurden dreifache Kulturen von WT Sterne, ΔantC und ΔantC/COMP in 200-ml-Kulturflaschen mit HIB + Proteaseinhibitoren gezüchtet und die Überstände nach 24 Stunden gesammelt (Abb. 4A). Die gefilterten Überstände wurden dreifach per Western Blot auf EF, LF und PA analysiert. Diese Ergebnisse zeigten deutlich erhöhte EF-Spiegel im ΔantC-Überstand im Vergleich zu WT und dem Komplement (Abb. 4B). Die LF-Werte im ΔantC-Überstand waren im Vergleich zu WT erhöht, wenn auch nicht signifikant. Die ΔantC-Werte im Vergleich zu ΔantC/COMP unterschieden sich deutlich (Abb. 4C). Der bei LF beobachtete Trend wurde in PA-Blots beobachtet, eine hohe Variabilität führte jedoch zu statistisch unbedeutenden Unterschieden (Abb. 4D). Diese Daten deuten darauf hin, dass alle Toxinspiegel im Überstand durch die ΔantC-Mutation in Sterne gestört wurden; einige deutlich.

Ödemfaktor, Letalfaktor und schützende Antigensekretion durch B. anthracis Sterne 34F2 werden in Abwesenheit von Anthrose gestört. Zur Bestätigung der Lumineszenzexpressionsstudien wurden die Stämme B. anthracis Sterne WT, ΔantC und ΔantC/COMP in HIB + Km 10 in Gegenwart von Proteaseinhibitoren in dreifacher, filtergereinigter 24-Stunden-Überstandsprobe gezüchtet. Die ODs bei 600 nm wurden über die Zeit gemessen (A) und die Überstände wurden auf (B) Ödemfaktor, (C) Letalfaktor oder (D) Schutzantigen geblottet. Die einzelnen Bandenintensitäten, ihr Durchschnitt und die Standardabweichung werden als Prozent des Wildtyps (WT) angezeigt. An den Zeitpunkten der Wachstumskurve wurde eine einfache ANOVA mit wiederholten Messungen durchgeführt, und die optischen Dichten unterschieden sich nicht signifikant von der WT in (A). Einweg-ANOVA-Tests wurden verwendet, um signifikante Unterschiede der Bandenintensitäten in (B–D) zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

In vorläufigen Experimenten wurde festgestellt, dass das Fehlen von Anthrose in unserem genetischen Sterne-Knockout die pagA-Expression in glukosehaltiger BHI-Brühe verringert (Abb. 5A und B). Dies stand im Gegensatz zu dem starken Anstieg der pagA-Expression, wenn die Sterne-ΔantC-Mutante in proteinreichem HIB-Medium gezüchtet wird, das keine Zucker enthält. Wenn während des Wachstums in BHI-Brühe exogene Anthrose hinzugefügt wurde, erhöhte sich die Expression von PpagA sowohl in WT (violette Linie in Abb. 5A) als auch in ΔantC Sterne (violette Linie in Abb. 5B). Viele Bakterien reagieren auf die Menge an Stoffwechselzwischenprodukten und modulieren die Genexpression entsprechend. Wir stellten die Hypothese auf, dass intrazelluläre oder extrazelluläre Anthrosespiegel die vegetativen Zellen durch eine Veränderung der Genexpression während des vegetativen Wachstums beeinflussen könnten. Wildtyp B. anthracis Sterne wurde in Gegenwart und Abwesenheit von exogen zugesetzter reiner Anthrose gezüchtet, um jede Möglichkeit einer Verfälschung der Daten in einer Deletionsmutante zu vermeiden. Die Bakterien wurden zu zwei Zeitpunkten nach der Zugabe von Anthrose, 30 Minuten und 2 Stunden, geerntet und mit nur mit Verdünnungsmittel behandelten Kulturen verglichen (Abb. 5C). Nach 30-minütiger Behandlung waren 6 Gene um mehr als das Zweifache signifikant hochreguliert, während 17 Gene herunterreguliert waren (Abb. 5D). Diese Gene waren hauptsächlich an der Bildung von Stoffwechselzwischenprodukten wie Pyruvat und Trehalose beteiligt. Das am stärksten hochregulierte Gen war ein mutmaßliches Membranprotein (log2FC = 10,98), gefolgt von einem Gen, das ein GerPF-Homolog mit einem log2FC von 10,98 kodierte. Die Mutation von Proteinen der GerPF-Familie wurde mit einem Phänotyp super-ruhender Sporen in Verbindung gebracht28. Das Gen, das die stärkste Herunterregulierung erfuhr, war ein mutmaßliches Lipoprotein (log2FC = −20,02). Nach 30 Minuten wurden keine Gene auf pXO1 nachgewiesen. Differenziell transkribierte Gene ab dem 30-Minuten-Zeitpunkt sind in Tabelle 2 aufgeführt. Nach 2 Stunden Anthrose-Behandlung erfuhren 52 Gene eine signifikante Hochregulierung, von denen 18 hypothetische Proteine ​​waren (Abb. 5E). Bei 45 Genen kam es in den Replikaten zu einer signifikanten Herunterregulierung, 13 davon waren hypothetische Proteine. Ein YfhD-ähnliches sporulationsspezifisches Sigma-F-reguliertes Protein wies einen log2FC von 116,33 auf. Proteine ​​der YfhD-Familie sind Transglycosylasen, die am Peptidoglycan-Abbau beteiligt sind. Dieses Gen wird in der Bacillus subtilis-Präspore exprimiert29 und ist eine der am häufigsten vorkommenden mRNAs in ruhenden B. subtilis-Sporen30. Die Expression dieses Proteins wird auch durch einen sporulationsspezifischen Sigmafaktor F reguliert. Drei hypothetische Gene von pXO1 wurden hochreguliert (log2FC von AW20_5643 = 32,20, AW20_5714 = 14,91 und AW20_5607 = 5,66). AW20_5643 (log2FC von 32,20) kodiert für ein Protein, das eine Nukleasedomäne enthält, und liegt unmittelbar stromabwärts von lef. Drei Gene, alle hypothetisch, von pXO1 wurden signifikant um mehr als das Zweifache herunterreguliert: AW20_5645 (log2FC = – 7,07), AW20_5667 (log2FC = – 1,45) und AW20_5770 (log2FC = – 1,16). AW20_5667 wird unmittelbar stromaufwärts von cya transkribiert und divergent transkribiert, während AW20_5645 zwischen lef und pagR liegt. Die Expressionsänderungen der Cya-, Lef- und Pag-Gene waren statistisch nicht signifikant, der Transkriptionsaktivator atxA (AW20_5658) erfuhr jedoch eine statistisch signifikante Unterdrückung von log2FC = − 0,62. Darüber hinaus wurden zum Zeitpunkt von 2 Stunden Transkriptionsregulatoren und andere sporenspezifische Gene identifiziert. Differenziell transkribierte Gene ab dem 2-Stunden-Zeitpunkt, einschließlich der auf pXO1 gefundenen Gene, sind in Tabelle 3 aufgeführt. Diese Daten deuten darauf hin, dass Anthrose eine Rolle in der Transkriptionslandschaft von vegetativ wachsendem B. anthracis spielt, indem sie als Induktor-/Repressormolekül eines noch nicht charakterisierten Phänomens dient Regulon. Die STRING-Netzwerkanalyse wurde verwendet, um funktionelle Gencluster in den 30-Minuten- (Abb. 5F) und 2-Stunden-Datensätzen (Abb. 5G) zu identifizieren. Interessanterweise wurde im 2-Stunden-Datensatz ein Cluster von GMP-Synthetase-Genen identifiziert. Wenn Anthrose als GMP-Synthetase-Inhibitor wirkt (um die GTP-Spiegel zu senken, wie die Beweise nahelegen), können die Bakterien GuaA hochregulieren, um eine Überkompensation herbeizuführen. Außerdem wurde ein Zweikomponenten-Chemotaxissystem identifiziert.

Anthrose induziert Veränderungen in der Expression des Schutzantigens und beeinflusst die globale Genregulation bei B. anthracis Sterne. (A) Der lumineszierende Reporterstamm B. anthracis Sterne Protective Antigen (PA) wurde 48 Stunden lang mit (lila Linie) und ohne (grüne Linie) 100 μg/ml reine Anthrose gezüchtet. (B) Der lumineszierende Reporterstamm B. anthracis Sterne ΔantC Protective Antigen (PA) wurde 48 Stunden lang in BHI-Brühe mit (violette Linie) und ohne (rote Linie) 100 μg/ml reine Anthrose gezüchtet. Wachstumskurven wurden in dreifacher Ausfertigung mit der OD bei 600 nm und den durchschnittlichen relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) und dem Standardfehler des Mittelwerts zu jedem Zeitpunkt erstellt. (C) Experimentelles Design zur Messung der globalen Transkriptomspiegel 30 Minuten und 2 Stunden nach Zugabe von 10 μg/ml reiner Anthrose zu in BHI gezüchtetem B. anthracis Sterne in der Log-Phase. Jede Probe wurde aus drei Experimenten entnommen und an RNA-seq übermittelt. (D) Genexpression von B. anthracis Sterne 30 Minuten nach Zugabe von 10 μg/ml reiner Anthrose im Vergleich zu einer parallel gezüchteten Scheinkultur (mit Wasser) und (E) nach 2 Stunden im Vergleich zu einer Scheinkultur mit Wasserbehandlung parallel. Rote Punkte zeigen signifikante Gene an, die eine Fold-Change von mehr als 2 oder weniger als -2 erfahren und eine Falscherkennungsrate von weniger als 0,05 haben. (F) String-Netzwerk-Funktionsanalyse von 30-minütigen Genclustern mit BAS-Loci-Markierungen. Die roten Cluster stehen im Zusammenhang mit Glukokinaseprozessen, die blaugrünen Cluster sind ATP-Transmembranprozesse und die gelben Cluster sind am Zuckerstoffwechsel beteiligt. Linien, die Gene verbinden, sind unterschiedliche Hinweise auf eine Interaktion. (G) String-Netzwerk-Funktionsanalyse von 2-h-Genclustern mit BAS-Locus-Markierungen. Biosyntheseprozesse von Nukleosidmonophosphat (GMP und CTP) sind Teil des roten Clusters, die Lachsgruppe umfasst glykolytische Prozesse, gelb sind andere Kohlenstoffstoffwechselprozesse und grün ist an Chemotaxis/Zweikomponentensystemen beteiligt. Linien, die Gene verbinden, sind unterschiedliche Hinweise auf eine Interaktion.

Unsere Beobachtung, dass reine Anthrose (selbst ein Zucker) die pagA-Expression verringert und Gene global stört, veranlasste uns zu untersuchen, ob das Vorhandensein von Anthrose an der Veränderung der Virulenzexpression durch den Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt ist. Mit 2 mg/ml Glukose enthält die BHI-Brühe neben reichhaltigen Proteinquellen auch einen hohen Zuckergehalt. Herzinfusionsbrühe (HIB) ist im Wesentlichen das gleiche Medium wie BHI ohne Dextrose. Lumineszierende Promotorfusionen für lef und atxA wurden in Sterne WT und die Sterne ΔantC-Mutante eingeführt und in BHI, HIB und HIB + 2 mg/ml Glucose gezüchtet, um ihre Expression in Medien mit hohem Proteingehalt und hohem Proteingehalt + Kohlenhydraten zu messen (Abb. 6A– D). Was in allen Abbildungsfeldern sofort erkennbar ist, ist, dass die Expressionstrends bei BHI (violette Linien) und HIB + 2 mg/ml Glucose (rote Linien) eher einander ähneln als bei der Expression bei HIB (orange). Die Expressionsmuster von Plef in BHI (violette Linien in Abb. 4A und B) ähneln denen, die für PpagA in Abb. 5A und B beobachtet wurden. Die Expression von PatxA in WT Sterne zeigt einen markanten Anfangspeak in einem Glucose enthaltenden Medium, nimmt dann ab und ist Variable danach (Abb. 6A violette und rote Linien). Im HIB-Medium zeigt die WT-PatxA-Expression ein hohes Maß an Induktion, wobei die RLU dreimal höher ist als in BHI oder HIB + Glucose (orangefarbene Linien in Abb. 6A). Die PatxA-Expression in ΔantC Sterne, gezüchtet in BHI und HIB + 2 mg/ml Glucose, zeigt den anfänglichen Anstieg der Expression und dann flache Linien, bis die Bakterien in die stationäre Phase eintreten, wo die Expression etwa 24 Stunden lang wieder ansteigt (Abb. 6B, violette und rote Linie). Die PatxA-Expression in ΔantC-Sternen, die in HIB gezüchtet wurden, ist im Vergleich zu den WT-Sternen geringer, was darauf hindeutet, dass die Produktion von Anthrose durch Bakterien in HIB die atxA-Expression beeinflussen könnte. Bei HIB erfolgt die Expression von Plef im WT in einem zweiphasigen Peak mit maximal 250 RLU (orange Linie in Abb. 6C). In Abb. 6D ist die Expression von Plef in in HIB gezüchteten ΔantC-Sternen als markanter Einzelpeak nach 24 Stunden mit einem Maximum von ~ 800 RLU erkennbar (orange Linie in Abb. 6D). Bei beiden Stämmen verschob die Zugabe von Glukose die Spitzenwerte nach rechts, vermutlich weil die Bakterien den Zucker bevorzugt verwerten. Der starke Anstieg der Expression von PatxA geht nicht mit der Expression von Plef einher, was darauf hindeutet, dass Anthrose die Expression von atxA auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene modulieren kann. In Abb. S5 zeigten paarweise absolute Unterschiede die ähnliche Wirkung von HIB + Glucose und BHI auf die Expression von PatxA und Plef, was die Rolle des Kohlenstoffstoffwechsels bei der Kontrolle von Toxin-Regulons unterstützt.

Lumineszierende Expressionsmuster von Virulenz-bezogenen Promotoren von B. anthracis werden durch Nährstoffkomponenten beeinflusst. Lumineszierende Ausdrucksmuster von (A) Sterne WT PatxA-lux (B) Sterne ΔantC PatxA-lux (C) Sterne WT Plef-lux und (D) Sterne ΔantC Plef-lux, (gewachsen in BHI + Km 10 (violette Linien), HIB + Km10 (orangefarbene Linien) oder HIB + Km10 + 2 mg/ml Glucose (rote Linien) zeigen, dass der Anthrose-Status unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression bei Nährstoffbedingungen mit hohem Protein- und hohem Zuckergehalt hat.

Anthrose als höchst einzigartiger Zucker könnte eine Rolle bei der intra-, inter- und extrazellulären Signalübertragung spielen. Es ist bekannt, dass B. anthracis als Keimmoleküle stark auf Nukleosidanaloga reagiert31,32,33. Darüber hinaus können nukleosidähnliche Moleküle die Sporulation auslösen34,35. Ein solches Analogon ist Decoyinin, ein Nukleosidanalogon, das von Streptomyces spp. produziert wird. Es ist ein GMP-Synthetase-Inhibitor und Streptomyces spp. Sporulationssignal und löst die Sporulation in B. anthracis aus. Decoyinin hemmt die GMP-Synthese und senkt dadurch die intrazellulären GTP-Spiegel, was zur Derepression von Genen des repressiven CodY-Regulons führt36. Die Promotorfusionen atxA, lef und pagA in den Stämmen WT (Abb. 7A – D) und ΔantC Sterne (Abb. 7E – H) wurden in proteinreichem HIB-Medium (rote Kurven) und mit Anthrose (orangefarbene Linien) gezüchtet Decoyinin (violette Linien). Die Zugabe von Decoyinin verringerte die Expression der drei getesteten Konstrukte in beiden Stämmen. Die Zugabe der gleichen Menge Anthrose verringerte die Expression ähnlich wie Decoyinin, wenn auch auf mittlerem Niveau. Paarweise Abstände zwischen lumineszierenden Expressionsreportern zeigen die ähnlichen Auswirkungen von Anthrose und Decoyinin auf Expressionsprofile von atxA-, lef- und pagA-Promotoren in WT- und ΔantC-Sternen (Abb. S6).

Anthrose und Decoyinin haben ähnliche Auswirkungen auf die Expressionsprofile toxinbezogener Gene. Lumineszierende Ausdrucksmuster von (A) Sterne WT Pant-lux, (B) Sterne WT PatxA-lux, (C) Sterne WT Plef-lux, (D) Sterne WT PpagA-lux, (E) Sterne ΔantC Pant-lux, ( F) Sterne ΔantC PatxA-lux, (G) Sterne ΔantC Plef-lux und (H) Sterne ΔantC PpagA-lux, gewachsen in HIB + Km 10 (rote Linien), HIB + Km10 + reine Anthrose (orange Linien) oder HIB + Km10 + Decoyinin (violette Linien) zeigen, dass exogene Anthrose unter Bedingungen mit hohem Proteingehalt und niedrigem Zuckergehalt ähnliche Auswirkungen auf die Genexpression hat wie Decoyinin; und meist während der stationären Phase.

Um zu sehen, ob die Expression des Anthrose-Operons und der Toxingene durch nativ relevante Mengen externer Anthrose moduliert werden kann, wurden die Stämme WT Sterne und ΔantC Sterne, die die leeren Expressionsvektoren enthielten, im Verhältnis 50:50 mit den relevanten Lumineszenzfusionsstämmen gemischt und in BHI gezüchtet Brühe (Abb. 8A–H) oder HIB-Brühe (Abb. 8J–R). In Übereinstimmung mit den Studien, in denen reine exogene Anthrose zu in BHI-Brühe gezüchteten Kulturen hinzugefügt wurde, führte die Co-Kultur mit Anthrose-positiven leeren Vektorstämmen im Vergleich zu einer erhöhten Expression der Lumineszenzpromotorfusionen sowohl im WT- als auch im ΔantC-Sterne-Hintergrund (blaue Linien). zu Co-Kulturen mit den ΔantC Sterne-Leervektorstämmen (rote Linien). Interessanterweise reduzierte die Co-Kultur mit dem leeren Vektorstamm ΔantC die Expression des Anthrose-Promotors (Abb. 8A, E, J und N; rote Linien im Vergleich zu blauen), unabhängig vom Medien- oder Anthrose-Status. Die Expression der lef- und pagA-Promotoren war bei Co-Kultivierung mit dem ΔantC-Leervektorstamm durchweg geringer, unabhängig vom Medien- oder Anthrosestatus des Reporterstamms. Wenn bei BHI die atxA-Fusionen im leeren Vektor-Anthrose-verwandten Stamm (like vs. like) gezüchtet werden, exprimieren sie von P-atxA, als ob sie in einzelnen BHI-Kulturen gezüchtet würden (Abb. 8B und F). Wenn eine der P-atxA-Fusionen in HIB mit der ΔantC-Mutante gezüchtet wird, ähnelt die Expression von P-atxA der von Monokulturen (Abb. 8K und O). Wie erwartet erzeugten leere Vektorstämme allein keine Lumineszenzsignale (Abb. 8I, R).

Die Kokultur mit Anthrose-positiven Stämmen beeinflusst die Expression von Virulenz- und Anthrose-Biosynthesegenen. Lumineszierende Ausdrucksmuster von (A) Sterne WT Pant-lux, (B) Sterne WT PatxA-lux, (C) Sterne WT Plef-lux, (D) Sterne WT PpagA-lux, (E) Sterne ΔantC Pant-lux, ( F) Sterne ΔantC PatxA-lux, (G) Sterne ΔantC Plef-lux, (H) Sterne ΔantC PpagA-lux bei Wachstum in BHI in einer 50:50-Mischung mit dem Stamm Sterne WT EV (blaue Linien in jedem Diagramm) oder Sterne ΔantC EV-Belastung (rote Linien in jedem Diagramm). (I) Zeigt, dass Reinkulturen des Stammes Sterne WT EV oder des Stamms Sterne ΔantC EV nicht lumineszierend sind. (J–R) sind die gleichen Co-Kulturstämme wie (A–I), wurden jedoch in HIB gezüchtet.

Unsere Ergebnisse identifizierten zahlreiche Ameisen-B. anthracis-Isolate, die über die zuvor beschriebenen WAG-Stämme hinausgingen. Was wir zunächst als einen auf Westafrika beschränkten Genotyp annahmen, umfasst Isolate aus der ganzen Welt, einschließlich exportierter Stämme und solcher, die an menschlichen Krankheitsereignissen beteiligt sind. Diese Ameisenstämme verursachen in den USA seit mindestens 1960 Tierinfektionen (Schafisolat 2002013072). Die treffend benannte Heroin-Gruppe und die neu entstehende „Djembe“-Gruppe sind zwei große Ameisengruppen, die mit gefährlichen, aufsehenerregenden exportierten Milzbrandereignissen in Verbindung gebracht werden, die zu Fällen bei Menschen führen. Das Vorhandensein von Ameisenstämmen in der Ames-Gruppe (Han und FDAARGOS_694), Südamerika und WAG weitet die beobachteten Ameisenstämme erheblich auf viele der wichtigsten A-Gruppen aus. Durch die Analyse des Exosporium-Napes haben wir auch gezeigt, dass das Fehlen von Anthrose im Exosporium zu einer geringeren Flordichte und einem verringerten Molekulargewicht des Hauptproteins des Exosporiums, BclA, führt. Durch die Entfernung von Anthrose veränderte sich das Bindungsprofil des menschlichen AVA-Impfstoffs, was auf eine Verringerung der Bindung impfstoffspezifischer Antikörper an hochmolekulares glykosyliertes BclA hindeutet. Dies veranlasste uns, das Vorhandensein sporenspezifischer Antikörperreaktionen im Immunserum zu untersuchen. Antikörper gegen nicht-proteinsporenspezifisches Material wurden im polyklonalen Kaninchenserum gegen lebende Sporen, im Sterne-geimpften Bisonserum und überraschenderweise in AVA-geimpften gepoolten menschlichen Seren gefunden. Der AVA-Impfstoff wird aus Alaun-adsorbiertem Filtrat vegetativer Zellen hergestellt und unsere Daten deuten darauf hin, dass Komponenten vorhanden sind, die Immunreaktionen auf Protein- und Nicht-Protein-Komponenten der B. anthracis-Spore stimulieren. Wir haben gezeigt, dass die Zugabe von exogener Anthrose bereits 30 Minuten nach der Exposition zu Transkriptionsänderungen in vegetativen Bakterien führt und ein sporenspezifisches Molekül mit Auswirkungen auf die Physiologie vegetativer Zellen verknüpft. Zwei Stunden nach der Exposition sind die sporulationsspezifischen Proteine ​​hochreguliert. Beispielsweise wird yfhD in der Vorspore als Reaktion auf Ethanolexposition oder Glukosemangel in Bacillus subtilis hochreguliert 37. Es ist auch die vorhergesagte Position einer ncRNA an ihrem 3'-Ende38. Dieses Gen erlebte 2 Stunden nach Zugabe von reiner Anthrose einen über 100-fachen Anstieg der Expression. In B. subtilis wird die Expression von yfhD durch Sigma-F reguliert, dessen Aktivität während der asymmetrischen Septierung der Vorspore unterdrückt wird 39. Mehrere hypothetische Proteine ​​auf pXO1 erfahren ein signifikantes Maß an unterschiedlicher Expression. Diese Transkriptionsänderungen könnten die treibende Kraft für die Mutation des Anthrose-Operons in vegetativen Zellen sein. Die hier präsentierte Zusammenstellung der Daten liefert weitere Informationen zu den Folgen der Anthrose-Mutation.

Wir haben gezeigt, dass Anthrose und Decoyinin über ähnliche Wege die Expression von Toxinen kontrollieren können. Experimente zeigten, dass das Ausschalten von Anthrose die Induktion im WT vom eigenen Promotor zum frühen stationären im Vergleich zum späten stationären verschob. Die Zugabe von exogener Anthrose oder Decoyinin unterdrückte die Expression von Pant im WT-Stamm, hatte jedoch nur geringe Auswirkungen auf ΔantC; möglicherweise aufgrund der anhaltenden Unfähigkeit, Anthrose zu produzieren. Wenn Anthrose zu Kulturen hinzugefügt wurde, die BHI-Brühe enthielten, die einen hohen Anteil an Glucose enthielt, wurde die Expression der pagA-Promotorfusion erhöht. Dies könnte durch die posttranskriptionelle Kontrolle von atxA durch das PTS-Zuckersystem und dessen Zusammenhang mit der wachstumsphasenabhängigen Nährstoffverfügbarkeit erklärt werden. CodY bindet verzweigtkettige Aminosäuren (BCAAs) und GTP und erhöht so seine Affinität zu seinen Zielen40. Wenn BCAAs und/oder GTP limitierend werden, wie etwa bei Sporulationsbedingungen in weniger komplexen Medien oder bei der Behandlung mit Anthrose oder Decoyinin bei HIB, ist CodY nicht in der Lage, an die Promotorregionen der von ihm regulierten Gene zu binden, was zu deren Derepression führt; Dazu könnte die Unterdrückung der bisher nicht identifizierten Protease gehören, von der angenommen wurde, dass sie die AtxA-Spiegel posttranslational steuert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der nachgelagerte Effekt der Behandlung mit Anthrose in Rich Media (BHI) eine höhere Expression von atxA und ein höheres Maß an Toxinexpression aufgrund der Dominanz von CodY-unabhängigen Mechanismen der Toxinregulation während des logarithmischen Wachstums ist; wie die Regulierung der atxA-Expression durch AbrB41. In späteren Wachstumsphasen dominiert die CodY-abhängige Regulierung der Toxinregulation und das Vorhandensein von Anthrose wird mit weniger aktivem atxA und einer geringeren Toxinexpression koordiniert. AbrB ist ein Repressor der atxA- und Toxin-Expression. AbrB wird normalerweise durch phosphoryliertes Spo0A (Spo0A ~ P) während logarithmischer Wachstumsbedingungen gehemmt, was die Expression von atxA und Toxin ermöglicht42. Unsere Daten zeigen, dass die atxA-Expression und die Toxin-Expression während des logarithmischen Wachstums in der Anthrose-Mutante im Vergleich zum Wildtyp Sterne stark unterdrückt sind. Allerdings waren die atxA-Expressionsniveaus nicht mit der Toxinexpression koordiniert. Niedrige atxA-Expressionsniveaus in der Anthrose-Mutante unterdrücken den anfänglichen Höhepunkt der Toxinexpression im Wildtyp. Der zweite Peak der Toxinexpression wird in der Anthrose-Mutante verstärkt. In diesem Sinne unterdrückt die Zugabe von exogener Anthrose diesen zweiten Höhepunkt der Toxinexpression sowohl in Anthrose-positiven als auch in Anthrose-negativen Sternen, was die Rolle von Anthrose bei der Regulierung der Toxinexpression beim Übergang zum stationären Wachstum und darüber hinaus weiter unterstützt. Co-Kulturexperimente zeigten, dass der Anthrosestatus von B. anthracis, der Nährstoffstatus von B. anthracis, mit dem sie wachsen, und die Nährstoffe, in denen sie wachsen, unterschiedliche Verschiebungen in der Expression wichtiger Virulenzgene verursachen können. Diese Muster müssen weiter untersucht werden, um die Signalhierarchie durch extrazelluläre und intrazelluläre Anthrose-Pools zu beurteilen und zu beurteilen, wie sie die Virulenzexpression in vivo beeinflussen.

Wir haben ein plausibles Modell erstellt, um unsere Ergebnisse im Kontext unserer zuvor veröffentlichten Daten zu subkutanen Anthrax- und Anthrose-negativen Sporen zusammenzufassen (Abb. 9). Abbildung 9 zeigt, wie im Verlauf einer subkutanen Infektion Anthrose-positive Milzbrandsporen keimen und Toxin absondern, um die systemische Ausbreitung lokaler Infektionen gemäß der Jail-Break-Hypothese der Verbreitung zu ermöglichen (Abb. 9A). Im Gegensatz dazu keimen Anthrose-negative Sporen nicht so schnell und interagieren effizienter mit professionellen Phagozyten an der Inokulationsstelle, was eine durch Phagozyten unterstützte Verbreitung in Sekundärgewebe ermöglicht, wie im Trojanischen Pferd-Modell der Anthrax-Verbreitung beschrieben. Eine geringere Toxinsekretion durch Anthrose-negative Sporen ermöglicht eine verstärkte Interaktion zwischen Bakterien und Phagozyten. Ein starker Anstieg der Toxinsekretion tritt auf, wenn die Proteinquellen begrenzt werden, was zu einer erhöhten Verbreitung und einer kürzeren mittleren Zeit bis zum Tod bei Mäusen und G. mellonella führt, wie bereits veröffentlicht. Dieses Modell trägt dazu bei, die In-vitro- und In-vivo-Ergebnisse rund um Anthrose-negative B. anthracis zu vereinheitlichen. In unserer früheren Arbeit fanden wir eine ähnliche Verringerung der LD50, wenn Mäuse auf intranasalem Weg mit der Anthrose-negativen Mutante in Kontakt gebracht wurden18. Extrapoliert man früher veröffentlichte Daten, die eine verstärkte Interaktion von Anthrose-negativen Sporen mit Makrophagen und eine stärkere Bindung an den Makrophagen-CD14-Rezeptor zeigen, könnte das Trojanische Pferd-Modell der durch Wirtszellen vermittelten Verbreitung begünstigt werden. Anthrose-negative Sporen könnten aufgrund der verstärkten Interaktion mit Phagozyten schneller aus dem bronchoalveolären Raum entfernt werden als Anthrose-positive Sporen. Eine Milzbrandinfektion ist ein Ausbreitungsspektrum, bei dem die Pathologie durch das Überleben der Bakterien und die Toxinsekretion in vivo vermittelt wird. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf akapsuläre B. anthracis Sterne und die Rolle von Anthrose bei der Toxinexpression. Unsere zukünftige Arbeit wird sich darauf konzentrieren, dieses Modell durch In-vivo-Messungen der Toxinsekretion, der Pathogenausbreitung und der zellulären Beteiligung sowie deren Auswirkungen auf die Pathogenese durch vollständig pathogen eingekapseltes B. anthracis zu testen. Die Kapsel ist ein wichtiger Virulenzfaktor, dessen Regulierung und Induktion durch die atxA-Expression43,44 gesteuert werden kann, wobei sowohl die atxA- als auch die Kapselexpression mit dem CO2-Spiegel verknüpft sind45. Wir beobachteten sowohl externe als auch interne Auswirkungen von Anthrose auf die atxA-Expression und zeigten gleichzeitig, dass wahrscheinlich auch andere Regulatoren beteiligt sind. Da wir im Rahmen dieser Arbeit die Rolle von Anthrose bei der Toxinexpression untersucht haben, besteht der nächste logische Schritt darin, zu verstehen, ob die Kapselexpression in B. anthracis beeinflusst wird und ob die Virulenz bei Tieren beeinflusst werden kann.

Modell des Anthrose-Status und der Verbreitung bei subkutanem Milzbrand. (A) Anthrose-positive Sporen keimen schneller und produzieren während des vegetativen Wachstums mehr Toxine. Professionelle Fresszellen an der Infektionsstelle werden durch die hohen Toxinwerte abgetötet. Im subkutanen Anthrax-Modell erfolgt die Ausbreitung auf Sekundärgewebe hauptsächlich nach der Infektion an lokalen Inokulationsstellen und dann über beschädigte Lymphgefäße; wie in der Jailbreak-Hypothese vorgeschlagen. (B) Anthrose-negative Sporen keimen langsamer und scheiden beim Keimen geringere Mengen an Toxin aus. Phagozyten überleben die verringerten Toxinspiegel, interagieren häufiger und phagozytieren Anthrose-negative Sporen häufiger als Anthrose-positive Sporen. Sporen und vegetative Zellen werden phagozytiert, überleben intrazellulär und werden in Sekundärgewebe transportiert, was zu einer höheren Gewebeverbreitung führt; wie im Trojanischen Pferd-Modell. Höhere Verbreitungsraten gehen mit einem Anstieg der Toxinsekretion einher, der mit einer verkürzten mittleren Todeszeit einhergeht, die bei Anthrose-negativen Sporeninfektionen beobachtet wird. Erstellt mit BioRender.com.

Die Erkennung exogener Anthrose (in trans) hat auch Auswirkungen auf die Pathogenökologie. Exogene Anthrose könnte, unabhängig davon, ob sie an einer Sporenoberfläche haftet oder frei schwimmt, Signale liefern, die vegetative Zellen zur Sporulation drängen und so ein Mittel zur Sporen-zu-vegetativen Zellkommunikation bei sporulationsinduzierenden Bedingungen bieten. Zuckerreste mit Strukturen, die Anthrose sehr ähnlich sind, finden sich in Kapseln, die in bestimmten Wachstumsstadien von Shewanella spp. produziert werden. Stamm MR-4 und als Glykosylierungen des Pseudomonas syringae Flagellum46. Shewanella spp. kommen in anaeroben Boden- und Wasserumgebungen vor, während P. syringae ein allgegenwärtiger Pflanzenpathogen ist. Sowohl der Boden als auch die Pflanzenumgebung sind Orte, an denen B. anthracis unter rauen Umweltbedingungen mit diesen beiden Bakterien interagieren würde. Es wäre interessant zu beurteilen, ob die Anthrosereste auf diesen nicht verwandten Gram-Negativen ausreichen, um die hier beobachteten Veränderungen der Genexpression in B. anthracis hervorzurufen. Bereitstellung einer weiteren Möglichkeit für B. anthracis, ungünstige Wachstumsbedingungen zu erkennen.

gDNA wurde aus 1 ml B. anthracis-Kulturen isoliert, die über Nacht in BHI-Brühe gezüchtet wurden, unter Verwendung des Dneasy UltraClean Microbial Kit (Qiagen: Germantown, MD, USA). Die DNA wurde unter Verwendung von Corning Costar Spin-X 0,22 mm Zentrifugalfiltern filtersterilisiert. Ein Zehntel des Probenvolumens wurde unter Schütteln in 3 ml BHI-Brühe inokuliert. Nach 48 Stunden wurden 100 ml der Probe auf BHI-Agar ausgebreitet, um die Sterilität der Probe zu überprüfen. Sterile Proben wurden aus dem High-Containment entnommen und die DNA wurde fragmentiert und für die Sequenzierung unter Verwendung des NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit (New England Biolabs: Ipswich, MA, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet. Die Proben wurden unter Verwendung von NEBNext Multiplex Oligos für Illumina (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA) gemultiplext. Das 600-Zyklen-MiSeq-Reagenzienkit v3 wurde zur Sequenzierung multiplexierter Proben auf dem MiSeq im Emerging Pathogens Institute der University of Florida, Gainesville, verwendet.

Blastn wurde zur ersten Identifizierung von Anthrose-Operon-Mutationen verwendet. Zur Analyse von Sequenzierungsdateien der nächsten Generation wurde die Hochleistungs-Forschungscomputerinfrastruktur HiPerGator an der University of Florida verwendet. Fastq-Dateien wurden vom öffentlich zugänglichen Sequence Read Archive (SRA) am NCBI oder dem EMBL European Nucleotide Archive oder von unseren eigenen Illumina MiSeq-Läufen heruntergeladen. Rohdaten wurden mithilfe von BWA-MEM47 dem B. anthracis-Ames-Vorfahren zugeordnet und mithilfe von IGV48 zur Überprüfung von Anthrose-Mutationen visualisiert. Die De-novo-Assemblierung von Genomen wurde erreicht, indem Fastq-Dateien mit Trimmomatic49 auf Qualität getrimmt, mit SPAdes50 zusammengestellt und mit Pilon51 poliert wurden. Die Qualität der Genomassemblierung wurde mit Quast52 überprüft. Die SNP-Analyse des gesamten Genoms wurde mit dem PhaME-Paket53 durchgeführt, das auf HiPerGator ausgeführt wurde, und Bäume wurden mit der RaxML-Option in PhaME54 erstellt. Phylogenetische Bäume wurden mit iTOL55 visualisiert.

Escherichia coli DH5α wurde als Klonierungsstamm verwendet und in LB-Brühe oder Agar bei 37 °C gezüchtet. Der mobilisierbare Stamm RHO3 wurde in Gegenwart von 200 μg/ml DAP (Millipore Sigma: Burlington, MA, USA) gezüchtet, um Plasmide in Wildtyp-B. anthracis zu konjugieren, wie zuvor beschrieben56,57. Die Gegenselektion wurde durch Weglassen von DAP aus dem selektiven Medium erreicht. Kanamycin wurde in E. coli-Stämmen mit 35 μg/ml und in B. anthracis-Stämmen mit 10 μg/ml verwendet. B. anthracis Sterne 34F2 wurde von Colorado Serum Company (USA) erhalten und mit BHI-Brühe oder Agar (Becton Dickinson: Franklin Lakes, NJ, USA) oder Herzinfusionsbrühe (HIB) gezüchtet; (Research Products International: Mount Prospect, IL, USA) bei 37 °C. Reine Anthrose wurde von Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) gekauft und Decoyinin wurde von Abcam (Waltham, MA, USA) bezogen. Die B. anthracis Sterne 34F2 ΔantC-Mutante und das Komplement wurden wie zuvor beschrieben erstellt18. Wildtyp-B. anthracis stammen aus der Martin E. Hugh-Jones Bacillus anthracis-Sammlung, die am Emerging Pathogens Institute der University of Florida untergebracht ist. Bakterien wurden mithilfe von BSL3-Praktiken und -Verfahren gemäß dem BMBL in einer von CDC/USDA inspizierten und registrierten Einrichtung manipuliert.

Sporen wurden wie zuvor beschrieben18 kurz präpariert. B. anthracis-Stämme wurden über Nacht in BHI-Brühe gezüchtet, auf Difco-Sporulationsmedium (DSM)-Agarplatten ausgebreitet und 5 Tage lang bei 30 °C inkubiert. Die Sporen wurden in kaltem, sterilem Wasser geerntet und durch Diatrizoesäure-Gradienten gereinigt. Die Pellets wurden 1 Stunde lang in 85 % Ethanol resuspendiert, um jegliche Übertragung vegetativer Zellen abzutöten, und dann vor der Zählung und Lagerung bei 4 °C in kaltem Wasser gewaschen.

Gefriersubstitution und Elektronenmikroskopie wurden wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt58. Sporen wurden 24 Stunden lang in Trumps Fixativ (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) suspendiert und bei 4 °C gelagert und dann 5 Minuten lang bei 10.000 U/min pelletiert (Fisher Scientific Micro). -Zentrifuge Modell 59A). Die Zellen wurden dann in 0,1 M Natriumkacodylat, pH 7,24, unter Verwendung einer Pelco BioWave Pro Labormikrowelle (Ted, Pella, Redding CA, USA) gewaschen. Die Sporen wurden in einen HPM100 3 mm, 200 μm tiefen Aluminium-Probenträger vom Typ A (Leica Microsystems, Wien, Österreich) gegeben, der mit 1-Hexadecen-Kryoprotektor vorgefüllt war. Die sporenhaltigen Probenträger wurden mit einem anderen Probenträger aus Aluminium vom Typ A abgedeckt und unter Verwendung von HPM 100 (Leica Microsystems, Wien, Österreich) unter hohem Druck eingefroren. Die gefrorenen Proben wurden in in flüssigem Stickstoff vorgekühlte Kryofläschchen überführt und dann mit 2 % (w/v) Osmiumtetroxid und 0,1 % Uranylacetat in wasserfreiem Aceton gefüllt. Die Gefriersubstitution wurde in einer Gefriersubstitutionseinheit (AFS2, Leica Microsystems, Wien, Österreich) bei –90 °C für 72 Stunden durchgeführt, die Temperatur wurde mit zwei weiteren Gefriersubstitutionsschritten bei –50 °C für 24 Stunden und – gesenkt 10 °C für 24 Stunden. Nach der Gefriersubstitution wurden die gefrorenen Proben von den Probenträgern entfernt, in wasserfreiem Aceton gewaschen und die Temperatur auf 4 °C erhöht. Die Harzinfiltrationsschritte wurden wie oben beschrieben in einer Labormikrowelle durchgeführt. Dehydrierte Proben wurden in abgestuftem Aceton-Embed/Araldite-Epoxidharz mit Z6040-Einbettungsgrundierung (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) zu 30 %, 50 %, 70 % und 100 % infiltriert und dann bei 70 °C ausgehärtet. Ultradünne Schnitte (ca. 120 nm) wurden auf 100 Mesh Formvar/kohlenstoffbeschichteten Kupfergittern gesammelt und mit 2 % wässrigem Uranylacetat und Reynolds Bleicitrat gegengefärbt. Die Schnitte wurden mit einem FEI Tecnai G2 Spirit Twin TEM (FEI Corp., Hillsboro, OR) untersucht, der bei 120 kV betrieben wurde, und digitale Bilder wurden mit einer Gatan UltraScan 2k × 2k-Kamera und Digital Micrograph-Software (Gatan Inc., Pleasanton, CA) am University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (Elektronenmikroskopie-Kern).

Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden mit Fiji59 analysiert. Exosporium-Nap aus 10 Bildern jedes Stammes wurde mithilfe einer 50-Pixel-Linienauswahl und der Begradigungsfunktion in Fidschi linearisiert. 3D-Oberflächenplot-Heatmaps wurden erstellt, indem der Flor von 10 zufällig ausgewählten Sporen mithilfe der 3D-Oberflächenplotfunktion ausgerichtet wurde. Von den begradigten Bildern wurden Histogramme erstellt und die Pixeldichte bestimmt.

Proben für Western Blots wurden gesammelt und 10 Minuten lang in Standard-SDS-PAGE-Probenpuffer gekocht. Die Proben wurden auf vorgefertigten 4–15 % SDS-Polyacrylamidgelen (BioRad: Hercules, CA, USA) 1 Stunde lang bei 120 V laufen gelassen. Die Proben wurden elektrotransferiert auf mit Methanol getränkte Immobilon PSQ PVDF-Membranen (Millipore-Sigma: Burlington, MA). , USA) mit einem halbtrockenen Transfer bei 17 V für 20 Minuten. Die Blots wurden mit 5 % Magermilch in 1xPBS + 0,05 % Tween 20 (PBST) 1 Stunde lang blockiert, bevor sie jeweils 3 Minuten lang 5x in PBST gewaschen wurden. Primärantikörper wurden im Verhältnis 1:1000 in Blockierungslösung unter leichtem Schütteln für 1 Stunde zugegeben. Nach weiteren fünf Waschrunden mit PBST wurden Nachweisantikörper im Verhältnis 1:1000 für kolorimetrische Blots oder 1:20.000 für Chemilumineszenz-Blots in Blockierungslösung für 1 Stunde zugegeben und dann erneut wie zuvor gewaschen. Für kolorimetrische Blots wurde 1-Step Ultra TMB Blotting Solution (ThermoFisher Scientific: Waltham, MA, USA) als Substrat verwendet, während SuperSignal West Pico PLUS (ThermoFisher Scientific: Waltham, MA, USA) das Substrat für Chemilumineszenz-Blots war. Beide Substrate wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Die Blots wurden auf einem BioRad Gel Doc XR + Gel-Dokumentationssystem (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA, USA) im Chemilumineszenzmodus mit 60 s manueller Belichtung abgebildet. Polyklonaler Ziegen-Anti-PA-Antikörper und rekombinantes PA wurden von List Labs bezogen. Der polyklonale Kaninchen-Anti-BclA-Antikörper (NR-9578) wurde aus BEI-Ressourcen bezogen. Die monoklonalen Mausantikörper LF-3H3 und LF-9A11 gegen LF (NR-12187 und NR-12188) und P2E3H4 gegen EF (NR-15473) wurden von BEI Resources erhalten. Die folgenden mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten sekundären Nachweisantikörper wurden verwendet: Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP (Invitrogen A16072), Ziegen-Anti-Mensch-IgG-HRP (Invitrogen 31.412), Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG-HRP (Sigma A8919) und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Sigma A0545). Das schützende Antigen wurde mittels ELISA mit dem Anthrax Protective Antigen 83 (PA83) Protein Quantitative ELISA (Alpha Diagnostics International; San Antonio, TX, USA; 800–100-P83) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen.

B. anthracis Sterne-Stamm 34F2 wurde über Nacht in BHI-Brühe bei 37 °C gezüchtet und auf eine OD600 von 0,5 standardisiert und in 6 Röhrchen aufgeteilt: dreifaches für reine Anthrose (Sigma) als Behandlung bei einer Endkonzentration von 10 μg/ml und dreifaches für einen Hauch Wasser hinzugefügt. Die Proben wurden dreifach 30 Minuten und dreifach 120 Minuten nach Einführung einer der beiden Flüssigkeiten gesammelt. Die Proben zu jedem Zeitpunkt wurden sofort mit dem Zymo Direct-zol RNA Miniprep Plus-Kit (Zymo Resrearch; Irvine, CA, USA) verarbeitet, einschließlich der optionalen Schritte des Perlenschlagens sowie der DNAse-Behandlung auf der Säule. Die resultierende RNA wurde auf einem NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA) quantifiziert und bei –80 °C aufbewahrt. Um kontaminierende rRNAs zu entfernen, wurden ~ 1,6 μg jeder Probe mit Terminator™ 5′-Phosphat-abhängiger Exonuklease (Lucigen; Middleton, WI, USA) behandelt und mit dem Ambion MEGAclear Transcription Clean-Up Kit (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA) bei der Entfernung von tRNAs und sRNAs. Nach einer rRNA-Abbauprüfung mittels eines Bleich-RNA-Denaturierungsgels wurden 60 Probenmengen über NanoDrop 2000 standardisiert.

RNAseq-Bibliotheken wurden mit dem NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep Kit für Illumina® gemäß der Empfehlung des Herstellers vorbereitet. Die resultierenden Probenbibliotheken wurden dann mithilfe eines hochempfindlichen DNA-Analysechips in einem Bioanalyzer 2100 (Agilent; Santa Clara, CA, USA) auf korrekte Größe untersucht. Die Bibliotheken wurden mit einem Illumina NovaSeq 6000 sequenziert. Die resultierenden Fastq-Dateien wurden mit der Tuxedo Suite63 an die PATRIC RNA Seq Analysis Pipeline61,62 übermittelt, um Transkripte zwischen Replikaten und die Signifikanz zwischen Behandlungen zu analysieren. Signifikante Gene wurden mit GraphPad Prism visualisiert. Die rohen und verarbeiteten Daten aus dem Experiment wurden im Gene Expression Omnibus hinterlegt und sind über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE220794 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc =) zugänglich GSE220794). Mithilfe einer String-Netzwerkanalyse wurden Cluster der Genregulation in diesen Datensätzen identifiziert64. Linien, die Gene verbinden, sind ein anderer Beweis für Interaktionen aus der STING-Datenbank, die mehrere bioinformatische Ressourcen durchsucht.

Das pRepU-kan-AmCyan-Plasmid wurde durch PCR-Amplifikation des Rückgrats mit den phosphorylierten Oligos RepUKanCFPFOR (5′-Phos/tttcattggatcccccgggagatc-3′) und RepUKanCFPREV (5′-Phos/agtgagtcgacctcgacaaaaga-3′) erstellt. Das PCR-Produkt wurde mit DpnI verdaut, um die Plasmid-Matrize zu entfernen, und dann selbstligiert. Das resultierende Plasmid wurde durch BamHI/KpnI verifiziert. Das pRepU-kan-AmCyan-antABCDSterne-Plasmid wurde durch Verdau von pRP1099 65 mit BamHI und SalI und Amplifikation des B. anthracis Sterne-antABCD-Operons durch PCR mit Q5-DNA-Polymerase und den Oligos AntAssemF2 (5′-acttcgttcttttgtcgaggCTTGTATTGTCCACTTATTTTATCCC-3′) und AntAssemR2 erstellt (5 ′-gatatcgagatctcccggggACATAATATCCCCTCATACACAC-3′). Das NEBuilder HiFi-DNA-Montagekit wurde verwendet, um das Plasmid-Rückgrat und das Anthrose-Operon durch Gibson-Assemblierung gemäß den Empfehlungen des Herstellers zusammenzubauen. Die korrekte Insertion wurde durch Doppelverdau des Inserts mit EcoRI und HindIII überprüft.

Das pRepU-kan-AmCyan-Plasmid wurde wie oben erstellt. pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux wurde wie zuvor beschrieben hergestellt66. Das für das grampositive Codon optimierte und neu angeordnete luxABCDE-Operon von pMV306-hsp-lux wurde von Addgene erhalten und wie in67 beschrieben erstellt. Der lef-Promotor wurde mit Plef-Up_NotI (5′-TAT GCG GCC GCG CAA AAA ACA AAC TAA AT-3′) und Plef-Dn_EcoRI (5′-ATG AAT TCT CTC CTT TTT TAT AA GTG-3′) amplifiziert und dann verdaut mit EcoRI und NotI wurde dann in pMV306-PpagA-lux66 eingefügt, das mit denselben Enzymen verdaut wurde, um pTs-repA-kan-Plef-lux zu erzeugen. pRP1099 wurde mit BamHI und SalI verdaut und mit dem Plef-lux-Fragment kombiniert, das mit NEBuildLEFLUXFWD (5′-TCT CGA CTT CGT TCT TTT GTC GAG GGC AAC GCG TGC G-3′) und NEBuildLEFLUXREV (5′-AAT TCG ATA TCG) amplifiziert wurde AGA TCT CCC GGG GTG ATC ACC GCG GCC ATG AT-3′) dann mit dem NEBuilder HiFi-Montagesatz zusammengebaut. Der EcoRI- und NotI-Verdau bestätigte eine 250-bp-Bande, die mit dem lef-Promotor übereinstimmte, und die Sequenz wurde durch Sanger-Sequenzierung mit dem Sequenzierungsoligo lux-seq (5′-CAA ACT CCG TGA AAT GAT GCT CC-3′) verifiziert. Zur Erstellung von pRepU-kan-AmCyan-PsigF-lux-Oligos PspoIIAAsigF.FOR ​​(5′-TCT CGA CTT CGT CGG CAA ATA TTT TGC CGC TTT TCT AT-3′) und PspoIIAAsigF.REV (5′-TTC CAA ATT TCA TAC GAT). TTC CTC CTT ATG CTC AAA CTT TAC TAA TT-3′) amplifizierte den spoIIAA-spoIIAB-sigF-Promotor und wurde mit dem pRepU-kan-AmCyan-lux-Fragment zusammengesetzt, das aus pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux mit Oligos LuxPspoAAIIsigF amplifiziert wurde. FOR (5′-GGA GGA AAT CGT ATG AAA TTT GGA AAC TTT TTG CTT ACA TAC CAA CCT CCC C-3′) und RepuKmPspoAA.REV (5′-AAA ATA TTT GCC GAC GAA GTC GAG ATC AGG GAA TGA GTT-3 '). Zur Erstellung von pRepU-kan-AmCyan-Pant-lux Oligos Pant.FOR (5′-TCT CGA CTT CGT CCG AAG GAA TGT AAA GAT GAT TAA TAT GGT AGT AGA ATA ATT TAA AG-3′) und Pant.REV (5′) -TTC CAA ATT TCA TAA AAA GTC CCC TTT TAA ATC CCT AAT TTT TCT-3′) amplifizierte den antABCDE-Promotor und wurde mit dem pRepU-kan-AmCyan-lux-Fragment zusammengesetzt, das aus pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux mit Oligos amplifiziert wurde LuxPant.FOR (5′-AGG GGA CTT TTT ATG AAA TTT GGA AAC TTT TTG CTT ACA TAC CAA CCT CCC-3′) und RepUPant.REV (5′-TAC ATT CCT TCG GAC GAA GTC GAG ATC AGG GAA TG-3). '). Zur Erstellung von pRepU-kan-AmCyan-PatxA-lux Oligos PatxA.FOR (5′-TCT CGA CTT CGT GTT CTA AAT CGT AAG GGG TTT TAT TAG TTA TAT TTC TTT TTT AGT TCA-3′) und PatxA.REV (5′) -TTC CAA ATT TCA TGT CTA TAA TTG ATT CTC CTT TCC TGT TGT G-3′) amplifizierte den atxA-Promotor und wurde mit dem pRepU-kan-AmCyan-lux-Fragment zusammengesetzt, das aus pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux mit Oligos amplifiziert wurde LuxPatxA.FOR (5′-TCA ATT ATA GAC ATG AAA TTT GGA AAC TTT TTG CTT ACA TAC CAA C-3′) pRepUKmPatxA.REV (5′-TAC GAT TTA GAA CAC GAA GTC GAG ATC AGG GAA TG-3′) . Das Vorhandensein jedes Promotors wurde durch PCR bestätigt und anschließend bestätigte die Sanger-Sequenzierung jedes Plasmids mit Oligo Lux-Seq (5′-CAA ACT CCG TGA AAT GAT GCT CC-3′) die erwartete Sequenz.

Für Lumineszenzwachstumskurven wurden Bakterien in HIB-Starterkulturen über Nacht mit 10 μg/ml Kanamycin, sofern erforderlich, gezüchtet. Die OD600 wurde durch 1:10-Verdünnung in frischem Medium und Rückrechnung mit dem Verdünnungsfaktor gemessen. Die Kulturen wurden in frischem, versuchsspezifischem Medium, das 10 μg/ml Kanamycin enthielt, auf eine OD600 von 1 normalisiert. Zur Beimpfung der verschiedenen Medien mit 1:40-Verdünnungen wurden normalisierte Kulturen verwendet. 150-μl-Aliquots wurden in schwarzen zellabweisenden optischen Bodenplatten mit 96 Vertiefungen (Greiner Bio-One; Monroe, NC, USA) gezüchtet. Die Tests wurden in einem Synergy Mx-Plattenlesegerät (BioTek; Winooski, VT, USA) bei 37 ° C und Orbitalschütteln mit 425 cpm durchgeführt. Die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und die relativen Lumineszenzeinheiten (RLUs) wurden 48 Stunden lang alle 10 Minuten aufgezeichnet. Jeder Assay wurde in biologischer Dreifach- und technischer Doppelbestimmung durchgeführt. Die Plattenlumineszenz wurde abgebildet, indem 20 μl 1:40 verdünnter Kulturen auf HIB + Km10-Agarplatten getupft wurden und nach 24-stündigem Wachstum bei 37 °C wie oben für chemilumineszierende Western Blots sichtbar gemacht wurden.

Co-Kulturexperimente wurden durchgeführt, indem Starterkulturen wie oben beschrieben gezüchtet wurden und dann entweder der nichtlumineszierende leere Vektor, der B. anthracis Sterne 34F2/pRepU-kan-AmCyan enthielt, oder der nichtlumineszierende B. anthracis Sterne 34F2 ΔantC/pRepU-kan- gemischt wurde. AmCyan-Stämme mit den angegebenen lumineszierenden Reporterstämmen im Verhältnis 50:50 oder allein in BHI + Km10 oder HIB + Km10. Lumineszenzsignale wurden wie in den anderen Lumineszenztests dieser Arbeit beschrieben gemessen.

Die Differenz zwischen zwei Zeitreihen kann entweder als Menge der Differenzen zwischen den Werten der ersten und zweiten Reihe für jeden Zeitpunkt (die entweder positiv oder negativ sein können, je nachdem, welcher Reihenwert größer ist) oder als Menge der absoluten Werte zusammengefasst werden Unterschiede für jeden Zeitpunkt (die nur nicht negativ sein können). Die Anzahl der Elemente in solchen Mengen entspricht der Anzahl der verglichenen Zeitpunkte zwischen den beiden betrachteten Serien.

Die paarweisen absoluten Unterschiede für jeden Zeitpunkt wurden visuell zusammengefasst, um zu sehen, wie sich diese Unterschiede im Laufe der Zeit veränderten (Abb. S5). Darüber hinaus wurden die Unterschiede auch als Histogramme dargestellt, die veranschaulichen, ob und wie oft eine Reihe tendenziell größer ist als die andere. In Abb. S6 wurden die paarweisen Differenzen mit dem entsprechenden Vorzeichen für jeden Zeitpunkt dargestellt, wobei die Werte über Null anzeigen, dass die erste verglichene Reihe größer ist als die zweite, und negative Werte das Gegenteil anzeigen.

Alle Daten dieser Arbeit sind im Manuskript, in dessen Ergänzung oder online verfügbar. Die rohen und verarbeiteten Daten aus dem RNA-seq-Experiment wurden im Gene Expression Omnibus hinterlegt und sind über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE220794 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi) zugänglich ?acc=GSE220794).

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Diese Arbeit wurde durch den DTRA STNI Award HDTRA121C0033 an MHN unterstützt. Wir danken Nicole J. Machi für die technische Unterstützung am UF ICBR Electron Microscopy Core.

Forschungslabor für räumliche Epidemiologie und Ökologie, Institut für Geographie, University of Florida, Gainesville, FL, USA

Michael H. Norris, Andrew P. Bluhm, Morgan C. Machine Gunner, Vertreter von Treenate, Ted Hadfield und Jason K. Blackburn

Emerging Pathogens Institute, University of Florida, Gainesville, FL, USA

Michael H. Norris, Andrew P. Bluhm, Morgan C. Machine Gunner, Vertreter von Treenate, Ted Hadfield und Jason K. Blackburn

Abteilung für Bevölkerungsgesundheitswissenschaften, School of Public Health, Georgia State University, Atlanta, GA, USA

Alexander Kirpich

Abteilung für Biologie, University of Florida, Gainesville, FL, USA

José Miguel Ponciano

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MHN konzipierte das/die Experiment(e), MHN, APB, MCM und TJ führten die Experimente durch und MHN, AK, TH, JMP und JKB analysierten die Ergebnisse. MHN hat den Originalentwurf verfasst und alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Michael H. Norris.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Norris, MH, Bluhm, AP, Metrailer, MC et al. Über die Spore hinaus beeinflusst der Exosporiumzucker Anthrose die vegetative Genregulation von Bacillus anthracis in cis und trans. Sci Rep 13, 5060 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32162-x

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Eingegangen: 19. Januar 2023

Angenommen: 23. März 2023

Veröffentlicht: 28. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32162-x

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